基于过程氧代谢和渗透压应激响应分析的乳酸发酵优化

发布时间：2020-11-01 20:15

　　 乳酸是一种天然存在的有机酸,广泛用于食品、化工、医药等行业。近年来,随着全球环保意识的不断加强,聚乳酸产品作为传统化石来源塑料的替代品,更是大大带动了全球范围对乳酸的需求。本论文以潜在工业生产菌拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)为研究对象,针对目前微耗氧乳酸发酵过程中氧代谢表征与控制难、发酵效率低、副产物含量高等突出问题,以细胞生理生化响应、关键酶活性检测、代谢轮廓和微观代谢流分析以及发酵液流变特性变化为指导,依据多尺度参数相关分析方法,深入挖掘发酵过程中氧代谢的作用机制,并详细解析了环境变量对细胞宏观和微观代谢的影响,从而理性指导拟干酪乳杆菌乳酸发酵过程的优化,实现了高糖浓度下,提高乳酸产量、产率和转化率的目的。本文首先研究了拟干酪乳杆菌发酵生产乳酸过程中的基本生理特性。发现(1)拟干酪乳杆菌在微耗氧条件下通过同型乳酸发酵代谢葡萄糖；(2)乳酸合成与菌体生长密切相关,其生长相关系数达到6.23,非生长相关系数为0.18；(3)中和剂添加量与乳酸合成量具有良好的线性关系,从而可以用于过程关键参数在线监测的实现；(4)生理参数二氧化碳释放速率(CER)与菌体生长速率具有很高的相关性,通过CER和呼吸商(RQ)能够有效指导发酵过程中分阶段氮源添加的优化策略,优化后使得产率和转化率分别提高5.94%和3.05%,副产物乙偶姻和乙酸含量分别下降24.68%和31.25%。其次,系统研究了拟干酪乳杆菌对氧代谢的代谢生化响应机理以及两阶段氧摄取速率(OUR)控制策略。由于乳酸发酵过程为微耗氧发酵过程,常规氧代谢表征参数溶氧(DO)和氧化还原电位(ORP)都存在明显的缺点,发酵液中DO往往低于电极的检测限,而后者很大程度上还受氧气以外其他具有氧化还原性化合物的影响。因此,在本文中利用过程尾气质谱分析技术首次将生理参数OUR引入到微耗氧乳酸发酵过程中用以定量表征菌体氧代谢。并根据氧代谢的特性,通过常规操作参数通气量来调节菌体的氧代谢水平,用于研究其对菌体生长和生理代谢的影响。具体研究结果如下：(1)发酵过程中,氧的消耗主要依赖于NADH氧化酶和电子传递链(ETC),而且前者主要作用于生长前期,而生长后期和稳定期则更多依赖于后者；(2)保证乳酸同型发酵的前提下(转化率大于80%),高OUR水平能够促进菌体的生长、葡萄糖代谢和乳酸合成,但是降低乳酸转化率；(3)在生长期,随着OUR水平的升高,总体丙酮酸代谢产生乙酰辅酶A的通量大大增加,造成乳酸转化率的明显下降,同时低OUR水平下丙酮酸主要通过PFL生成乙酰辅酶A,而高OUR水平下,丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶系(PDH)产生乙酰辅酶A的比例显著上升；(4)高OUR水平使得NAD。再生能力更加灵活,而且高产ATP(相对于乳酸合成途径)的乙酸途径明显加强,因此促进葡萄糖代谢通量增加以及对能量的合成用于菌体生长；(5)生长期OUR水平对丙酮酸代谢的变化主要通过乙酰辅酶A节点的通量比例来体现,从而实现胞内氧化还原环境(NAD+/NADH比例)的调节。(6)进入稳定期后,胞内代谢轮廓和关键酶酶活分析表明3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是控制糖酵解途径通量的关键节点,而高OUR水平会加剧胞内ROS水平的升高,并严重抑制GAPDH的活性,从而大大降低葡萄糖代谢水平；(7)葡萄糖代谢通量的减小和乳酸转化率的下降这两个方面共同作用是造成高OUR水平下乳酸产率低的原因,而且丙酮酸合成乳酸途径的调控发生在代谢水平(胞内更低的NADH水平和高NAD+/NADH比例)而不是酶学水平(乳酸脱氢酶的活性基本不变)；(8)胞内代谢通量分布表明同生长期一样,OUR水平仍作用于丙酮酸代谢,但是此时对于胞内NADH和NAD’平衡的调节更依赖于乙偶姻节点的作用,而不是乙酰辅酶A节点；(9)分析胞内NADH利用情况发现,高OUR水平下乳酸的NADH利用效率显著下降,从94.5%下降到84.5%,而副产物途径以及电子传递链的利用则增加；(10)ATP合成效率和组成比例的分析表明高OUR下菌体对ATP更为依赖,同时更多通过副产物和电子传递链途径来高产ATP,从而来响应更强的氧化应激。基于上述研究结果,我们建立了两阶段OUR控制策略,使得乳酸产率较单OUR控制(0.14mmol/L/h)提高了12.7%,而且乳酸转化率也比0.43mmol/L/h提高了4.04%。此外,发酵液流变特性显著影响气泡大小分布,氧传递系数(kLa)和氧传递速率(OTR)。因此氢氧化钙作为中和剂时发酵表现优于氨水和氢氧化钠是因为此条件下菌体具有更高的氧代谢水平。本论文还研究了渗透压和中和剂对乳酸合成的影响机理。高糖浓度乳酸发酵过程中中和剂不仅影响菌体氧代谢水平,更主要体现在环境渗透压的差异上。乳酸钙低溶解度和乳酸铵高渗透压是限制发酵后期高效生产的主要原因,并不是NH4’或LA。以及乳酸分子的积累。通过摇瓶和5 L发酵罐验证,存在三个显著影响拟干酪乳杆菌生长和代谢的渗透压水平。当渗透压低于1800 mOsm/kg时,菌体生长和代谢不受影响；处于1 800-3000 mOsm/kg时,菌体生长受到一定程度抑制,但是代谢基本没有影响；大于3000mOsm/kg时,菌体生长和代谢都受到显著抑制；一旦渗透压达到3600 mOsm/kg时,菌体生长和代谢都几近停止。时序测定细胞膜脂肪酸组成的变化发现随着发酵的进行(渗透压不断升高),细胞膜中不饱和脂肪酸／饱和脂肪酸的比例大大上升,而且其中环氧脂肪酸含量也明显升高。胞内代谢物图谱则表明EMP、TCA、PPP途径的各中间代谢物含量明显下降,而几种可能存在的潜在渗透压保护剂(甘油,甘露醇,脯氨酸和天冬氨酸)含量则显著上升。通过摇瓶和上罐验证,发现外源添加2 g/L脯氨酸,细胞能够通过外源摄取并在胞内积累来抵抗高渗应激,但是脯氨酸的保护效果具有一定的作用范围(3000-3600 mOsm/kg),一旦当环境渗透压高于菌体的耐受阂值(拟干酪乳杆菌为3600mOsm/kg左右)时,其效果大大减弱。除此之外,过程控制策略也能有效缓解发酵后期的高渗应激。本研究中开发的中和剂组合策略不但避免了高乳酸钙浓度引起的结晶,而且大大降低了环境渗透压。结果表明此策略下乳酸产率较单独氨水作中和剂时的产率提高了2.21倍,而且乳酸转化率也略有提升。最后,探索了新型基因编码荧光探针Frex在检测拟干酪乳杆菌胞内NADH中的应用。鉴于辅因子NADH在乳酸发酵过程中的重要作用,但是对其实时、动态,并且高时空分辨的检测仍是一个重大难题。本文应用杨弋教授课题组开发的一种基因编码荧光探针(Frex),将其首次导入到乳酸菌中,并进行初步的应用。虽然重组菌在代谢强度上要弱于原始菌,但仍能够有效表征原始菌在乳酸发酵过程中的生长和代谢特性。各种环境应激扰动的结果(包括辅因子、葡萄糖、丙酮酸、鱼藤酮和环境ORP),证实了Frex探针对NADH的特异性响应,以及其在拟干酪乳杆菌中应用的可行性。同时将Frex探针应用到实际乳酸发酵(不同OUR水平)的过程检测中,再一次证明了氧代谢水平在乳酸发酵过程中的重要调节作用。同时我们也希望Frex探针作为一种强有力的NADH活体检测手段广泛应用到其它生物过程中。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：TQ921.3
【部分图文】：

?－ｌｉｍｅ（ｈ）??图４．２不同ＯＵＲ水平下，ＤＯ和ＯＲＰ?（Ａ）、ＯＵＲ?（Ｂ）、ＮＡＤＨ氧化酶活性（Ｃ）和单位菌体??电子传递链还原能力（Ｄ）随发酵时间的变化。图４．２Ｄ中所有值通过测定产生的化ｒｎｉａｚａｎ浓度表??征，并！＾＾不通气条件下〇？１值作为对照??Ｆｉｇ．?４．２?Ｐ阳ｆｉｌｅｓ?ｏｆ?ＤＯ?ａｎｄ?ＯＲＰ?（Ａ），ＯＵＲ?（Ｂ），?ＮＡＤＨ?ｏｘｉｄａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?（Ｃ）?ａｎｄ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ＥＴＣ?ｒｅｄｕｃｉｎｇ??ｃａｐａｃｉｔｙ?（Ｄ）?ｕｎｄｅｒ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ＯＵＲ?ｌｅｖｅｌｓ?ｄｕｒｉｎｇ?ｔｈｅ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．?Ａｌｌ?ｖａｌｕｅｓ?ｉｎ?Ｆｉｇ．?４．２Ｄ??ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ?化ｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｏｒｍａｚａｎ?ｐｅｒ?ｇｒａｍ?ＤＣＷ?ｗｅｒｅ?ｒｅｐｏｒｔｅｄ?ａｓ?ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ?ｏｆ?ｖａｌｕｅ??ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ａｌ?０?ｈ?ｗｉｔｈ?ｎｏ?ａｅｒａｔｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ??在乳酸菌氧代谢中，由于细胞缺少完整的电子传递链，因此对于氧气的消耗主要依??靠细胞质中ＮＡＤＨ氧化酶。此外，部分电子传递链（主要为辅酶Ｑ和ＮＡＤＨ脱氨酶）??也被认为能够有效还原环境中氧气。Ｔａｃｈｏｎ等人ｌｉｗｉ发现在￡ａ＂ｏｃｏｃｃｗｓ?／口Ｃ化中ＤＯ的??消耗主要依赖于ＮＡＤＨ氧化酶，而且部分电子传递链同时作用于除了?ＤＯ?Ｗ外的其它??氧化还原物质。因此，我们时序测定了不同ＯＵ民下胞内ＮＡＤＨ氧化酶活性和电子传递??链还原能力

页?华东理工大学博±学位论的电子传递链，因此菌体能量的合成主要通过底物水平磯酸化来完成。当葡萄成己酸时，１?ｍｏｌ葡萄糖的消耗伴随４?ｍｏｌ?ＡＴＰ的生成，而乳酸合成只伴随２?因此乙酸合成相对乳酸合成来说是一个高产ＡＴＰ的过程。因此，在高ＯＵＲ胞用于生长的能最利用率要高于低ＯＵＲ水平，从而能够有效促进生长（图４．５有报道也指出乙酸的合成与还原力的平衡有关，特别是涉及到与细胞生长相ＰＨ。相比之下，不同ＯＵＲ水平下，甲酸合成量贝ＩＪ正好与乙酸相反（图４．９８）。和丙厕酸甲酸裂解酶有关，这个酶对氧气敏感，因此在低ＯＵＲ水平下甲酸的高，同时丙剛酸在甲酸裂解酶和丙酬酸脱氨酶复合体系作用下的产物都为乙醜作为前体进入到细胞的合成代谢中，包括ＴＣＡ循环Ｕ及细胞膜脂肪酸等，因水平更多的通过甲酸合成途径来补偿己醜辅酶Ａ的不足，从而满足细胞生长

?第巧页??的代谢通量的比例，包括訊酸，石酸和己偶姻（图４．１０）。Ｔａｈｖａｌｋａｒ和Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ［ｉ７ｉ］??在益生菌的研究中指出（Ｚａｃ／ｏｂａｃＷｗ?和公抑沁山ｍ?ｓｐｐ．），葡萄糖代谢??的终产物受氧浓度显著影响。而Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ?［７２］等人也报道称，胞内ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比例是??控制Ｌ．?／ｆｌｃ化由同型乳酸发酵向异性乳酸发醇转变的主要因素。本研究中ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ??比例的变化图说明稳定期相对还原的环境更有利于细胞的代谢和现酸的合成，其中胞外??ＯＲＰ图谱也从侧面证实了这个结论。而且在我们Ｗ前通过ＯＲＰ控制拟干酪郭杆菌乳酸??生产乳酸的研巧工作中也发现环境０民Ｐ在－２５０?ｍＶ左右比在－１００?ｍＶ左右更有利于菌??体合成乳酸。另外，从能量角度分析可得，高ＯＵ民糖酵解速率的下降限制了能量的利??用效率，这就导致郭酸的产生不能快速有效的分泌到胞外，可能影响胞内ｐＨ。一般来??说，乳酸菌在有氧条件下合成乙酸和ｐＨ中性的立偶姻来代替乳酸是因为；（１）乙酸的??合成伴随ＡＴＰ的生成，可用于胞内Ｈ＋的排出；（２）?ｐＨ中性的己偶姻合成能够有效缓解??细胞的酸应激；（３）?ＮＡＤ＋除了通过乳酸脱氨酶再生外还可Ｗ通过胞质ＮＡＤＨ氧化酶
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本文编号：2866038