神经退行性疾病相关物质的光谱分析

发布时间：2020-11-02 06:25

　　 阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease,AD)作为一种典型的神经退行性疾病,其病理特征主要表现为患者脑部老年斑大量形成及神经原纤维缠结。其中,老年斑主要由β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)及Zn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)等金属离子组成。随着全球老龄化的日益严重,AD对人类健康的危害也愈演愈烈。迄今为止,AD的发病机理依旧没有明确的解析,同时也缺少有效的治疗手段阻止或逆转疾病。因此,神经退行性疾病相关的金属离子及Aβ斑块的研究是AD病理特征解析及治疗的关键。光谱分析是神经退行性疾病相关的金属离子与Aβ斑块的重要研究手段。一方面,针对重要的金属离子,利用双光子比率型荧光探针穿透能力强、背景信号低及组织损伤小的优点,可实现金属离子的生物传感。金属离子能影响Aβ蛋白的折叠与聚集,进而影响老年斑的产生、生长及其结构。因此,另一方面,利用偏光分析可进一步解析Aβ斑块的结构、生长机制及金属离子、抑制剂等对其生长过程的影响。然而,实现金属离子的荧光分析及Aβ斑块相关的偏光分析仍然具有挑战。目前的挑战主要在以下三个方面:(1)实现脑切片及斑马鱼中金属离子的生物传感,需构建高双光子吸收截面(100 GM)的探针;(2)已报道的双光子比率型金属离子荧光探针大多需要加入大量的有机溶剂,为了更好地将探针用于生物传感,需提高探针的水溶性;(3)在淀粉样蛋白堆积球晶的研究中,偏光分析的巨大潜力远远没有得到发挥,亟需建立完整、系统的Aβ斑块偏光分析研究。本论文就上述提出的关键科学问题,展开了以下三个工作:(1)为了获取更高的双光子吸收截面,我们合成了具有高选择性、高时空分辨率的双光子比率型探针5,5-bis((E))-4-((2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-yl)oxy)-3,5 dimethylstyryl)-2,2′-bipyridine(P-Zn)。P-Zn探针与Zn~(2+)作用后,双光子吸收截面最大值由516±77 GM增至958±144 GM。P-Zn探针也具有高稳定性、低毒性以及良好的生物相容性等优点。通过AD鼠脑切片和正常鼠脑切片的荧光成像对比,发现AD鼠脑切片中存在明显的斑块,且该斑块中Zn~(2+)的含量高于正常鼠脑。(2)为了克服探针水溶性差的缺点,我们使用二甲基吡啶胺的衍生物作为Zn~(2+)的络合剂,合成了具有较高水溶性、高选择性的双光子比率型荧光探针(E)-1-(6-(4-(2-(2-(2-methoxyethoxy)ethoxy)eth-oxy)-3,5-dimethylstyryl)quinolin-2-yl)-N,N-bis(pyridin-2-ylmethyl)methanamine(TEO-MPVQ)。TEO-MPVQ探针具有组织穿透能力强、生物损伤小及响应时间短等特性。神经元成像表明NO刺激下,内源性Zn~(2+)会从神经元中的金属硫蛋白迅速释放,减小细胞内Zn~(2+)的浓度。(3)金属离子与Aβ斑块的形成密切相关,我们系统地研究了Aβ斑块的结构、生长机制及金属离子等关键生物分子离子对其生长过程的影响。研究表明,Aβ斑块在患者脑中以球晶的形式存在。通过溶剂挥发法制备得到大量Aβ_(1-16)球晶,证实Aβ_(1-16)球晶是由Aβ纤维堆积组成的。穆勒矩阵偏光成像研究表明,Aβ_(1-16)球晶的线性双折射角度与球晶中纤维的快速生长方向平行。Zn~(2+)及Cu~(2+)通过成核作用及配位作用两种方式影响Aβ_(1-16)球晶的生长,使Aβ_(1-16)球晶的生长速度随Zn~(2+)及Cu~(2+)的浓度的改变,出现先增大后减小的现象。为进一步探究外源物质与纤维的相互作用,考察了大量染料分子在球晶中的排列,证实罗丹明B等染料均沿球晶径向排列。进一步推测抑制剂主要通过与Aβ纤维径向之间相互作用,从而减慢Aβ纤维径向方向生长,降低球晶生长速度。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R749.16;O657.3
【部分图文】：

华东师范大学博士学位论文2p25片段，该片段激活会激酶，引起Tau蛋白过度磷酸化进而导致AD中出现NFTs。[13-15]老年斑是由细胞外β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）的沉积及相关的轴突和树突损伤引起的，主要分布在边缘皮质和缔合皮质。[16]正常情况下机体内Aβ的产生和降解是平衡的，一旦淀粉样前体蛋白（AmyloidPrecursorProtein，APP）相关的酶的功能异常或基因突变，就会导致Aβ的产生快于Aβ的清除，最终引起Aβ的堆积，形成早期老年斑。早期老年斑对神经细胞而言具有很强的神经毒性，最终会导致神经元的变性和功能障碍。突触功能紊乱也与老年斑的产生密切相关，[17]如图1.1所示，APP在突触前末梢的囊泡中形成Aβ，过量的Aβ会与突触后的神经营养蛋白、乙酰胆碱、蛋白激酶B等受体结合，进而引起神经递质在突触间的传递受阻，使得突触后端末梢的长时程增强作用减弱，长时程抑制作用增强，突触强度降低，学习和记忆能力下降，最终产生AD。[18-22]Aβ级联假说是目前该疾病致病机理的主要假说，研究发现Aβ形成纤维状聚集后具有神经毒性，进一步会产生氧化应激作用及炎症损伤，且生物体内，Aβ积累先于并驱动Tau蛋白的聚集。[23]因此，Aβ的研究对老年斑结构及形成机制的解析及AD的治疗有着极其重要的意义。图1.1AD中的突触紊乱行为。1.1.2阿尔兹海默症相关物质AD的病理过程中伴随着错误折叠的蛋白质的堆积、氧化应激及炎症损伤，

华东师范大学博士学位论文3这些过程会更进一步导致能量衰竭和突触功能障碍。Aβ、Tau蛋白、活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）、活性氮（ReactiveNitrogenSpecies，RNS）及金属离子在这些过程中发挥着十分重要的作用。（1）老年斑形成过程中的β-淀粉样蛋白Aβ是代谢的天然产物，由36-43个氨基酸组成。人体内Aβ1-40单体比易聚集且生物损伤大的Aβ1-42单体普遍得多。[24]如图1.2所示，APP通过β-淀粉样前体蛋白裂解酶1（Beta-siteAmyloidPrecursorProtein–CleavingEnzyme1，BACE-1）、β-分泌酶、γ-分泌酶及早老素1的蛋白质复合物等一系列酶促作用水解产生Aβ。[25]通过唐氏综合征等遗传性疾病及Aβ1-42细胞毒性实验研究发现，Aβ的产生和清除不平衡，会导致多肽聚集，进而导致Aβ积累，该过程可以认为是AD的起因之一。[26-27]Aβ会自发地聚集成多种形式共存的物理状态，其中一种形式由寡聚体（2至6个多肽）组成的聚集中间体。该中间体经过进一步堆积可形成具有β-折叠结构的片状结构，进而形成早期老年斑。根据文献报道，相比于老年斑，可溶性寡聚体（二聚体和三聚体）及聚集中间体具有更强的神经毒性，[28-29]且AD中认知缺陷的严重程度也与寡聚体的含量有密切关系，[30]因此，Aβ的研究对老年斑的结构及形成机制的解析具有着重要的指导作用。图1.2Aβ的产生过程。（2）神经原纤维缠结过程中的Tau蛋白NFTs的主要成分是聚集的过度磷酸化的Tau蛋白。[31]如图1.3所示，四个重复序列（R1-R4）可组成Tau蛋白与微管结合域（Microtubule-BindingDomain，

华东师范大学博士学位论文4MBD）。正常情况下，Tau蛋白的轴突中含有丰富的可溶性蛋白，可促进微管的组装及囊泡的稳定性运输。而高度磷酸化的Tau蛋白不溶，对微管缺乏亲和力，并且会缔合成成对的螺旋结构。添加去磷酸盐残基的酶可调节Tau蛋白磷酸化的程度。与Aβ低聚物一样，Tau蛋白的中间聚集体也具有细胞毒性并会损伤认知。[32-33]过度磷酸化的Tau蛋白中T181和T231氨基酸残基及脑脊液Tau蛋白的总含量可以作为具有轻度认知障碍的早期AD患者的生物标志[34]。图1.3Tau蛋白的产生机制和功能。（3）氧化应激过程中的活性氧、活性氮及金属离子AD中功能异常的线粒体会释放氧化自由基引起氧化应激。[35-36]如图1.4所示，Aβ可作为ROS和RNS有效产生剂。[37]线粒体中的过氧化氢（H2O2）会扩散到细胞质中，并参与到金属离子催化的羟基自由基（·OH）形成过程中。[38]受刺激的小胶质细胞是一氧化氮（NO）的主要来源，这些ROS和RNS会破坏细胞中的分子靶标。同时由磷脂膜的过氧化产生的有毒的醛类会损害线粒体酶。而细胞中的其他必需蛋白会直接被氧化，生成羰基和硝化衍生物。随后，磷脂膜对钙离子（Ca2+）的渗透性增加，进而导致其他离子失衡及葡萄糖转运受损，
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本文编号：2866688