葡激酶的聚乙二醇定点修饰产物制备及药学性质研究

发布时间：2017-04-08 23:25

  本文关键词：葡激酶的聚乙二醇定点修饰产物制备及药学性质研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰可有效地提高蛋白质药物在体内的循环半衰期、降低药物对蛋白水解酶的敏感性和免疫原性。葡激酶(staphylokinase,SAK)是一种可用于治疗心肌梗死的新型溶栓制剂,它的作用底物纤溶酶原是一种生物大分子。SAK的体内循环半衰期较短,并且对人体具有较强的免疫原性,PEG修饰技术可以很好地解决葡激酶存在的这些临床缺陷。但是,PEG分子对蛋白质表面的空间屏蔽作用会影响蛋白质药物与其底物的相互作用,从而引起蛋白质药物的生物活性降低,这一问题在以生物大分子为作用底物的蛋白质药物中尤为严重。本研究以SAK作为模型蛋白,通过调节PEG与SAK之间的连接桥,改变PEG的构象及其对蛋白质的空间屏蔽效应,以期找到一种提高PEG化蛋白质生物活性的方法。选择远离蛋白质的活性区域进行定点修饰是降低PEG分子对蛋白质活性影响的有效方法。本论文中所使用的SAK为重组蛋白,在远离其活性区域的C-末端引入了半胱氨酸残基。然后,通过3种不同的异型双功能小分子分别将一个PEG-20K共价连接在SAK的C-末端自由巯基上。制得的3种单一定点PEG化SAK具有基本相同的结构,唯一的差别在于PEG分子与SAK之间的连接桥。这3种连接桥为苯基、丙基和戊基,其中苯基代表刚性结构,丙基和戊基代表柔性结构(丙基和戊基可被视为不同长度的柔性结构)。圆二色光谱和荧光光谱检测结果表明,在这3种PEG修饰产物中,SAK蛋白质本身的结构均未发生明显变化。动态光散射和分析超离心检测结果显示刚性连接桥介导形成致密的PEG构象,PEG以紧致的结构覆盖于修饰位点附近；而柔性连接桥可介导形成疏松的PEG构象,PEG可以舒展地覆盖于SAK的表面。对于远离活性中心修饰的SAK,局部致密的PEG构象对SAK的空间屏蔽效应较小。对修饰产物的药学性质进行研究,发现局部致密的PEG构象既能有效地提高蛋白质的循环半衰期,降低药物对蛋白水解酶的敏感性和免疫原性,同时能更大限度地保持蛋白质的体外生物活性(比延展疏松的PEG构象高15%)本研究进一步制备了6种SAK的单PEG修饰产物,分别涉及到了PEG的链长、修饰位点和PEG与蛋白质之间的连接桥这3种影响PEG修饰蛋白质的因素。将修饰产物在70℃下加热孵育2 h,进一步研究了PEG的构象及其与蛋白质的生物活性之间的关系。圆二色光谱和荧光光谱检测结果表明,较高的PEG分子量、远离活性区域、延展疏松的PEG构象在保护蛋白质结构方面更具优势。分析超离心研究结果显示加热作用使得PEG构象由延展疏松变为局部致密。这种构象转变使得通过戊基连接桥介导的PEG-20K修饰SAK产物中的PEG活性区域的屏蔽效应变小,相对生物活性升高(～27%)。这个结果进一步说明了局部致密的PEG构象可降低PEG对蛋白质药物的空间屏蔽效应,提高PEG化蛋白质药物的生物活性。本研究的修饰策略可对其它以生物大分子为作用底物的蛋白质药物的PEG修饰方法提供借鉴。
【关键词】：PEG修饰 葡激酶 空间屏蔽效应 生物活性 加热处理
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1 文献综述14-56
• 1.1 蛋白质药物简介14-15
• 1.2 蛋白质药物的聚乙二醇修饰15-19
• 1.2.1 聚乙二醇及聚乙二醇化蛋白质药物的性质15-17
• 1.2.2 聚乙二醇修饰蛋白质药物的研究进展17-19
• 1.3 蛋白质药物的聚乙二醇修饰策略19-33
• 1.3.1 聚乙二醇分子量的选择20-21
• 1.3.2 聚乙二醇形状的选择21-22
• 1.3.3 聚乙二醇修饰位点的选择22-30
• 1.3.3.1 随机修饰22-25
• 1.3.3.2 末端-NH_2修饰25-26
• 1.3.3.3 巯基定点修饰26-28
• 1.3.3.4 二硫键定点修饰28-29
• 1.3.3.5 酶催化介导的定点修饰29-30
• 1.3.4 特殊PEG修饰策略30-32
• 1.3.4.1 活性位点的保护30-31
• 1.3.4.2 可逆PEG修饰31
• 1.3.4.3 非共价PEG修饰31-32
• 1.3.5 固相修饰32-33
• 1.4 聚乙二醇化蛋白质药物的分离纯化33-37
• 1.4.1 按分子体积的不同进行分离33-35
• 1.4.1.1 凝胶过滤层析33-34
• 1.4.1.2 超滤34-35
• 1.4.2 按静电作用力的不同进行分离35-36
• 1.4.3 按疏水性的不同进行分离36-37
• 1.5 聚乙二醇修饰蛋白质药物的表征和结构分析37-45
• 1.5.1 电泳法37-38
• 1.5.2 凝胶过滤高效液相色谱法38-39
• 1.5.3 反相高效液相色谱法39-40
• 1.5.4 质谱40
• 1.5.5 圆二色光谱40-41
• 1.5.6 荧光光谱41-42
• 1.5.7 动态光散射42-43
• 1.5.8 分析超离心43-44
• 1.5.9 红外光谱44
• 1.5.10 核磁共振技术44-45
• 1.6 聚乙二醇修饰蛋白质的药学性质分析45-47
• 1.6.1 表面等离子共振45-46
• 1.6.2 酶联免疫吸附试验46-47
• 1.7 模型蛋白葡激酶的研究进展47-53
• 1.7.1 葡激酶的结构47-48
• 1.7.2 葡激酶的溶栓机理48-50
• 1.7.3 葡激酶的临床应用和免疫原性50-51
• 1.7.4 葡激酶改造研究进展51-53
• 1.7.4.1 定点突变51-52
• 1.7.4.2 融合蛋白52
• 1.7.4.3 聚乙二醇修饰52-53
• 1.8 论文的立题思想53-56
• 2 基于连接桥的葡激酶C-末端定点修饰产物制备及鉴定56-80
• 2.1 引言56-58
• 2.2 实验材料与设备58-59
• 2.3 实验方法59-65
• 2.3.1 重组葡激酶的表达与纯化59-60
• 2.3.2 葡激酶的PEG定点修饰产物的制备与纯化60-61
• 2.3.2.1 修饰剂衍生物的合成60
• 2.3.2.2 葡激酶修饰产物的制备60-61
• 2.3.2.3 葡激酶修饰产物的纯化61
• 2.3.3 检测方法61-65
• 2.3.3.1 蛋白质浓度测定61-62
• 2.3.3.2 还原性SDS-PAGE62-64
• 2.3.3.3 凝胶过滤高效液相色谱分析64
• 2.3.3.4 反相高效液相色谱分析64
• 2.3.3.5 傅里叶变换红外光谱64-65
• 2.3.3.6 核磁共振光谱65
• 2.3.3.7 质谱65
• 2.3.4 数据统计分析65
• 2.4 实验结果与讨论65-78
• 2.4.1 重组葡激酶的表达与纯化65-67
• 2.4.2 葡激酶的PEG定点修饰67-72
• 2.4.2.1 修饰剂衍生物的合成67-69
• 2.4.2.2 葡激酶修饰产物的制备69-70
• 2.4.2.3 葡激酶修饰产物的纯化70-72
• 2.4.3 葡激酶修饰产物的鉴定72-78
• 2.4.3.1 还原性SDS-PAGE72-73
• 2.4.3.2 质谱73-75
• 2.4.3.3 凝胶过滤高效液相色谱75-76
• 2.4.3.4 反相高效液相色谱76-78
• 2.5 本章小结78-80
• 3 基于连接桥的葡激酶定点修饰产物结构及药学性质研究80-120
• 3.1 引言80
• 3.2 实验材料与设备80-81
• 3.3 实验方法81-90
• 3.3.1 体外生物活性81-82
• 3.3.2 表面等离子共振82
• 3.3.3 圆二色光谱82-83
• 3.3.4 荧光光谱83-84
• 3.3.4.1 内源荧光光谱83
• 3.3.4.2 外源荧光光谱83
• 3.3.4.3 荧光淬灭83-84
• 3.3.5 动态光散射84
• 3.3.6 分析超离心84
• 3.3.7 蛋白水解酶敏感性84
• 3.3.8 免疫原性84-86
• 3.3.8.1 动物免疫85
• 3.3.8.2 血清中抗-SAK的IgG滴度测定85-86
• 3.3.9 药代动力学性质86-89
• 3.3.9.1 动物实验方案87
• 3.3.9.2 抗SAK多克隆抗体的纯化87-88
• 3.3.9.3 酶标抗体的制备88
• 3.3.9.4 血药浓度测定88-89
• 3.3.10 分子动力学模拟89-90
• 3.4 实验结果与讨论90-117
• 3.4.1 体外生物活性90-92
• 3.4.2 表面等离子共振92-95
• 3.4.3 圆二色光谱95-97
• 3.4.4 荧光光谱97-102
• 3.4.4.1 内源荧光光谱97-98
• 3.4.4.2 外源荧光光谱98-99
• 3.4.4.3 荧光淬灭99-102
• 3.4.5 动态光散射102-104
• 3.4.6 分析超离心104-106
• 3.4.7 蛋白水解酶敏感性106-109
• 3.4.8 免疫原性109-110
• 3.4.9 药代动力学性质110-115
• 3.4.9.1 抗SAK多克隆抗体的纯化110-112
• 3.4.9.2 酶标抗体的制备112-113
• 3.4.9.3 血药浓度测定113-115
• 3.4.10 分子动力学模拟115-117
• 3.5 本章小结117-120
• 4 加热对PEG化SAK结构及活性的影响120-140
• 4.1 引言120-121
• 4.2 实验材料和仪器121
• 4.3 实验方法121-123
• 4.3.1 葡激酶的修饰产物的制备和纯化121-122
• 4.3.1.1 葡激酶的N-末端单一定点修饰产物的制备和纯化121-122
• 4.3.1.2 葡激酶的C-末端单一定点修饰产物的制备和纯化122
• 4.3.2 加热处理122-123
• 4.3.3 还原性SDS-PAGE123
• 4.3.4 凝胶过滤高效液相色谱123
• 4.3.5 圆二色光谱123
• 4.3.6 内源荧光广谱123
• 4.3.7 分析超离心123
• 4.3.8 溶剂可及化表面积123
• 4.4 实验结果及讨论123-137
• 4.4.1 葡激酶修饰产物的分析鉴定123-125
• 4.4.2 葡激酶修饰产物经加热处理后的生物活性分析125-128
• 4.4.3 圆二色光谱法128-130
• 4.4.4 内源荧光光谱法130-132
• 4.4.5 凝胶过滤高效液相色谱132-133
• 4.4.6 分析超离心133-135
• 4.4.7 溶剂可及化表面积135-137
• 4.5 本章小结137-140
• 5 结论与展望140-144
• 5.1 本论文的研究结果140-141
• 5.2 本论文的创新点141-142
• 5.3 今后的研究方向142-144
• 符号表144-146
• 参考文献146-160
• 附录A 图目录160-162
• 附录B 表目录162-164
• 附录C 方程目录164-166
• 个人简历及发表文章目录166-168
• 致谢168

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