药食同源夏枯草多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究

发布时间：2017-04-12 13:25

  本文关键词：药食同源夏枯草多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：夏枯草是一种药食同源的多年生草本植物(唇形科夏枯草属),广泛分布于中国、韩国、日本和欧洲地区。在中国作为保健食品和传统中药被广泛用于治疗黄疸、肝病、淋病、肺结核和糖尿病等疾病;而在华南地区,人们又常将夏枯草用于煲汤或熬制凉茶。化学植物素研究表明夏枯草含有多种活性成分,其中多糖是其最主要的活性成分之一。本论文系统地研究了夏枯草多糖的提取、分离纯化、理化性质及构效关系,并研究了夏枯草多糖锌螯合物的制备、抗增殖活性及其作用机理,为夏枯草多糖源保健品或临床药物的开发提供理论依据。主要研究结果如下:(1)夏枯草的基本组成为:水分22.4%、灰分12.13%、总蛋白10.63%、总脂肪4.53%、粗纤维24.75%和总糖9.81%。采用响应面分析方法来优化超声提取夏枯草多糖,以多糖提取率为响应值,得出最优提取工艺条件为:料液比1:25,超声功率210 W,提取时间50 min;提取温度70°C,在此最优提取条件下,多糖的最大提取率为2.11%。此多糖中总多糖、蛋白质、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸及总多酚含量分别为87.5%、11.4%、6.26%、0.37%和1.95%;分子量分布为4720 kDa(56.1%)、31.8 kDa(3.02%)、4.87 kDa(11.6%)和0.69 kDa(29.2%);单糖组成包括鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩尔百分比含量分别为2.8%、28.2%、38.5%、11.0%、3.0%和16.5%。活性研究表明夏枯草多糖具有良好的清除DPPH和ABTS自由基能力和铁还原能力,还能够显著地抑制人肝癌细胞HepG2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的增殖,而对正常肝细胞L02毒性较弱。(2)采用热水浸提法提取夏枯草多糖(PV-P),经离子交换柱层析分离得到一种中性多糖PV-P1(水洗脱组分),两种酸性多糖PV-P2(0.1 M NaCl洗脱组分)和PV-P3(0.2 M NaCl洗脱组分),其中PV-P1含量最高,占40.6%,PV-P2和PV-P3分别占5.34%和20.1%。化学组成和结构分析表明它们具有不同的化学组成、单糖组成和糖苷键类型,PV-P1具有较高的分子量大小和分支度,而PV-P2和PV-P3相似;此外,三组分均不具有三螺旋构象。活性研究表明三多糖组分均具有显著的抗氧化和免疫活性,其中PV-P2和PV-P3的抗氧化较强,能够显著地清除DPPH自由基、ABTS自由基和HOO自由基;而PV-P1的免疫活性最强,能够显著地刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌细胞免疫因子,如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-6),且对RAW264.7细胞基本无毒性。(3)多糖组分PV-P1经葡聚糖凝胶柱层析纯化得到一种夏枯草杂多糖,命名为P1。研究结果表明P1为分子量较均一的杂多糖,呈类球型构象,其均值分子量大小为1750kDa,由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔百分比含量分别为28.37%、54.67%、5.61%、5.46%和5.89%;高碘酸氧化-Smith降解和核磁共振(NMR)结果表明P1主要由(1→5)-linkedα-L-Ara、(1→)-linkedα-L-Ara、(1→3)-linkedα-D-xyl、(1→3)-linkedβ-D-Gal、(1→3,6)-linkedβ-D-Gal、(1→3,6)-linkedα-D-Man和(1→6)-linkedα-D-Glc等糖苷键连接而成。免疫机理结果表明P1能够通过RAW264.7细胞膜上TLR2、TLR4和CR3受体的识别来激活免疫应答。此外,P1在pH 4.0-10.0和低于121°C条件范围下处理,能够保持较高的免疫稳定性。(4)采用夏枯草多糖P1与醋酸锌反应制得了夏枯草多糖锌螯合物(P1-Zn),锌元素含量达到27 mg/g,螯合方式以C-O-Zn配位为主。P1-Zn能够显著地抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,且呈剂量依赖效应,当浓度为500μg/mL时,细胞增殖抑制率达98.4%;形态学观察结果表明P1-Zn能够导致细胞生长密度降低,贴壁性减弱,细胞间隙变大,细胞粘附性变差,细胞核缩小,染色质凝缩,出现凋亡体;抗增殖机理研究结果表明P1-Zn可以通过使HepG2细胞的周期阻滞在G0/G1期和线粒体途径诱导的凋亡两方面来抑制HepG2细胞的增殖。(5)体内动物实验研究结果表明夏枯草多糖能够提高大鼠血清中抗氧化酶活性,包括超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),尤其当高剂量300mg·kg-1·d-1时;此外,夏枯草多糖能够有效地提高大鼠的胸腺指数、脾脏指数及血清中免疫细胞因子IFN-γ和IL-6的含量;这些结果表明了夏枯草多糖具有体内抗氧化和免疫调节活性。
【关键词】：夏枯草多糖 结构鉴定 抗氧化 免疫调节 抗增殖
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ464.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-17
• 第一章 绪论17-37
• 1.1 引言17
• 1.2 夏枯草化学成分的研究进展17-19
• 1.2.1 多糖类18
• 1.2.2 三萜及其苷类化合物18
• 1.2.3 甾醇类18-19
• 1.2.4 黄酮类19
• 1.2.5 有机酸类19
• 1.2.6 挥发油19
• 1.3 夏枯草药理活性的研究现状19-22
• 1.3.1 免疫调节作用19-20
• 1.3.2 抗肿瘤作用20-21
• 1.3.3 护肝作用21
• 1.3.4 抗氧化作用21
• 1.3.5 降血糖作用21-22
• 1.3.6 抗菌和抗病毒作用22
• 1.3.7 降血压作用22
• 1.3.8 其它药理作用22
• 1.4 活性多糖的研究现状22-27
• 1.4.1 多糖的提取方法23-24
• 1.4.2 多糖的纯化方法24-25
• 1.4.3 多糖的分离方法25-26
• 1.4.4 多糖的结构鉴定方法26-27
• 1.5 本课题的研究意义及主要内容27-29
• 1.5.1 研究背景及意义27
• 1.5.2 研究目标27
• 1.5.3 主要研究内容27-28
• 1.5.4 研究的技术路线28-29
• 参考文献29-37
• 第二章 优化超声提取夏枯草多糖及其结构和生物活性的初步研究37-65
• 2.1 前言37
• 2.2 实验材料与试剂37-39
• 2.3 实验仪器与设备39
• 2.4 实验步骤39-48
• 2.4.1 夏枯草原料的预处理39-40
• 2.4.2 夏枯草基本成分的测定40
• 2.4.3 夏枯草多糖的超声提取方法40
• 2.4.4 夏枯草多糖的总糖含量测定40-41
• 2.4.5 响应面优化超声提取夏枯草多糖的实验设计41-42
• 2.4.6 夏枯草多糖的初步纯化42
• 2.4.7 蛋白质含量测定42
• 2.4.8 多酚含量测定42
• 2.4.9 糖醛酸含量测定42-44
• 2.4.10 分子量测定44
• 2.4.11 红外光谱测定44-45
• 2.4.12 单糖组成测定45
• 2.4.13 核磁共振测定45-46
• 2.4.14 抗氧化活性测定46-47
• 2.4.15 抗增殖活性测定47-48
• 2.4.16 数据分析48
• 2.5 实验结果与讨论48-60
• 2.5.1 夏枯草基本成分48
• 2.5.2 葡萄糖标准曲线48-49
• 2.5.3 响应面法优化夏枯草多糖的提取工艺条件49-52
• 2.5.4 化学组成和结构特征52-58
• 2.5.5 抗氧化活性58-60
• 2.5.6 细胞毒性60
• 2.6 本章小结60-61
• 参考文献61-65
• 第三章 夏枯草多糖的分离纯化、结构鉴定及抗氧化活性65-87
• 3.1 前言65-66
• 3.2 实验材料与试剂66
• 3.3 实验仪器与设备66-67
• 3.4 实验步骤67-71
• 3.4.1 夏枯草多糖的制备67
• 3.4.2 夏枯草多糖的分离纯化67-68
• 3.4.3 化学组成分析68-69
• 3.4.4 甲基化分析69
• 3.4.5 分子量测定69
• 3.4.6 红外光谱测定69
• 3.4.7 三股螺旋结构测定69-70
• 3.4.8 抗氧化活性测定70-71
• 3.4.9 数据分析71
• 3.5 实验结果与讨论71-81
• 3.5.1 夏枯草多糖不同组分的主要成分71-72
• 3.5.2 分子量分布72-74
• 3.5.3 红外光谱74
• 3.5.4 单糖组成74-76
• 3.5.5 糖苷键连接方式76
• 3.5.6 构象76-77
• 3.5.7 抗氧化活性77-81
• 3.6 本章小结81-82
• 参考文献82-87
• 第四章 一种夏枯草多糖的制备、结构表征及免疫调节活性87-115
• 4.1 前言87-88
• 4.2 实验材料与试剂88-89
• 4.3 实验仪器与设备89
• 4.4 实验步骤89-94
• 4.4.1 夏枯草多糖的免疫活性测定89-90
• 4.4.2 夏枯草多糖P1的制备90-91
• 4.4.3 理化性质及组成分析91
• 4.4.4 分子量测定91
• 4.4.5 单糖组成测定91-92
• 4.4.6 高碘酸氧化与Smith降解92-93
• 4.4.7 核磁共振测定93
• 4.4.8 原子力显微镜测定93
• 4.4.9 免疫活性测定93-94
• 4.4.10 免疫稳定性测定94
• 4.4.11 数据分析94
• 4.5 实验结果与讨论94-110
• 4.5.1 PV-P1、PV-P2及PV-P3的免疫活性94-96
• 4.5.2 PV-P1、PV-P2及PV-P3的细胞毒性96
• 4.5.3 P1的理化性质96-97
• 4.5.4 P1的紫外扫描光谱图97
• 4.5.5 P1的红外光谱及糖醛酸含量97-99
• 4.5.6 P1的纯度及分子量大小99
• 4.5.7 P1的单糖组成99-100
• 4.5.8 高碘酸氧化与Smith降解100-102
• 4.5.9 P1的糖苷键连接方式102-103
• 4.5.10 P1的原子力显微镜图像103-104
• 4.5.11 不同浓度P1对小鼠巨噬细胞免疫的影响104-105
• 4.5.12 TLR2、TLR4、CR3和Dectin-1 对P1诱导RAW264.7 细胞免疫的影响105-107
• 4.5.13 不同温度和pH处理对P1免疫活性稳定性的影响107-110
• 4.6 本章小结110
• 参考文献110-115
• 第五章 夏枯草多糖锌的制备、结构表征及抗增殖活性研究115-135
• 5.1 前言115-116
• 5.2 实验材料与试剂116-117
• 5.3 实验仪器与设备117
• 5.4 实验步骤117-121
• 5.4.1 夏枯草多糖锌螯合物的制备117
• 5.4.2 结构表征117-118
• 5.4.3 抗增殖活性测定118
• 5.4.4 抗增殖活性的机理研究118-121
• 5.4.5 数据分析121
• 5.5 实验结果与讨论121-132
• 5.5.1 夏枯草多糖锌螯合物的结构特征121-123
• 5.5.2 抗增殖活性123-124
• 5.5.3 细胞形态学124-126
• 5.5.4 细胞凋亡126-127
• 5.5.5 细胞周期停滞127-129
• 5.5.6 细胞线粒体膜电位损耗129-130
• 5.5.7 细胞内Caspase活性变化130
• 5.5.8 胞内活性氧含量变化130-131
• 5.5.9 信号传导通路131-132
• 5.6 本章小结132
• 参考文献132-135
• 第六章 夏枯草多糖体内抗氧化和免疫调节活性135-141
• 6.1 前言135-136
• 6.2 实验材料与试剂136
• 6.3 实验仪器与设备136
• 6.4 实验步骤136-138
• 6.4.1 实验动物136-137
• 6.4.2 动物分组及实验设计137
• 6.4.3 临床观察及体重分析137
• 6.4.4 抗氧化酶活性的检测137
• 6.4.5 免疫调节活性137-138
• 6.4.6 数据分析138
• 6.5 实验结果与讨论138-139
• 6.5.1 临床观察及大鼠体重138
• 6.5.2 血清抗氧化酶活性138-139
• 6.5.3 大鼠脏器指数及细胞免疫因子139
• 6.6 本章小结139-140
• 参考文献140-141
• 结论与展望141-145
• 一、结论141-143
• 二、创新点143-144
• 三、展望144-145
• 攻读博士学位期间取得的研究成果145-147
• 致谢147-148
• 附件148

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陆军;秦蕊;叶松;邓云;胡忠昌;;夏枯草提取物对MDR-MTB感染小鼠细胞免疫功能的影响[J];临床检验杂志;2012年01期

2 郭英;李桂梅;郜明;庄玲玲;丁婷;吴慧平;;夏枯草水提物对ICR小鼠餐后高血糖的影响[J];东南大学学报(医学版);2010年01期

3 魏明;熊双丽;金虹;徐国波;夏翠;;夏枯草水溶性酸性多糖的分离及活性分析[J];食品科学;2010年01期

  本文关键词：药食同源夏枯草多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：301387