恰塔努加链霉菌纳他霉素高效生物合成的分子机制
发布时间：2021-05-06 12:06
纳他霉素是一类多烯类抗生素,在食品和医疗上被广泛用作抗真菌剂,由于工业菌发酵水平较低,限制其广泛应用。纳他霉素合成过程为典型的I型PKS途径,但其系列合成反应如何高效链接、形态分化与合成途径如何协同等机制至今未有清晰解析,本研究以纳他霉素工业菌株恰塔努加链霉菌L10为研究对象,对其高效生物合成的分子机制进行较为深入的研究,同时为工业菌高产改造提供了理论依据。首先解析了纳他霉素合成途径的后修饰机制。通过对其中5个后修饰酶编码基因进行遗传改造,获得了4,5-脱环氧脱糖纳他霉素、4,5-脱环氧纳他霉素、4,5-脱环氧-12-脱羧基-12-甲基纳他霉素及其脱水化合物等纳他霉素类似物,其中后2个为新化合物。生物指示试验结果显示,其中后3个类似物具有一定的抗真菌活性。scnD的缺失株不产生纳他霉素但积累高产量的4,5-脱环氧纳他霉素,scnK, scnJ和scnC的缺失株均不产生纳他霉素而累积大量的4,5-脱环氧脱糖纳他霉素。scnG的缺失株也不产纳他霉素,而产生4,5-脱环氧-12-脱羧基-12-甲基纳他霉素及其脱水化合物。此外,scnG相连的scnF缺失株中纳他霉素产量降低了53%,同源糖基转...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词和术语表
第一章 绪论
1.1 链霉菌的形态发育
1.2 纳他霉素生物合成研究进展
1.2.1 纳他霉素的生物合成基因簇
1.2.2 纳他霉素内酯环合成的起始
1.2.3 纳他霉素内酯环合成的延伸
1.2.4 纳他霉素内酯环的后修饰
1.3 纳他霉素生物合成调控机制
1.3.1 途径特异性调控因子
1.3.2 全局多效调控
1.4 次级代谢产物产量的提高及其代谢酶的研究策略
1.4.1 高表达正相关结构基因
1.4.2 敲除负相关结构基因
1.4.3 体外稳态动力学分析次级代谢酶浓度的适配性
1.4.4 体内分析次级代谢酶的可用诱导型启动子
1.5 本文的研究内容及意义
1.5.1 本文的研究内容
1.5.2 本课题的意义
第二章 纳他霉素合成途径的后修饰机制解析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株
2.2.2 质粒
2.2.3 引物
2.2.4 主要仪器与设备
2.2.5 培养基及培养条件
2.2.6 常用试剂
2.3 实验方法
2.3.1 S.chattanoogensis基因组DNA的抽提
2.3.2 DNA片段的PCR扩增
2.3.3 DNA片断的处理
2.3.4 大肠杆菌质粒抽提
2.3.5 大肠杆菌Cosmid抽提
2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
2.3.8 孢子悬液的制备
2.3.9 S.chattanoogensis和E.coli ET12567的属间接合转导
2.3.10 PCR-targeting基因敲除
2.3.11 S chattanoogensis单交换突变株的获得
2.3.12 S.chattanoogensis双交换突变株的获得
2.3.13 S.chattanoogensis发酵、产物处理、HPLC和ESI-MS检测
2.3.14 RNA的抽提、基因组DNA的消解、反转录及qRT-PCR
2.3.15 纳他霉素生物指示试验
2.4 实验结果
2.4.1 基因缺失株构建与验证
2.4.2 基因缺失株的回补菌株构建与验证
2.4.3 纳他霉素生物合成过程中两个中间代谢产物的鉴定
2.4.4 scnD缺失株产物鉴定
2.4.5 scnK、scnJ和scnC缺失株产物鉴定
2.4.6 scnG缺失株产物鉴定
2.4.7 scnF的缺失导致纳他霉素产量下降
2.4.8 外源糖基转移酶回补scnK缺失株
2.4.9 纳他霉素类似物的抗真菌活性分析
2.5 本章小结与讨论
第三章 纳他霉素高效生物合成的分子机制
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株
3.2.2 质粒
3.2.3 引物
3.2.4 主要仪器与设备
3.2.5 培养基及培养条件
3.2.6 常用试剂
3.3 实验方法
3.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3
3.3.2 链霉菌重组蛋白的表达
3.3.3 链霉菌总蛋白的提取及SDS-PAGE和Western Blot检测
3.4 实验结果
3.4.1 系列诱导载体的构建过程
3.4.2 恰塔努加链霉菌egfp基因体内绿色荧光表达
3.4.3 最佳诱导浓度的确定
3.4.4 最佳诱导剂添加时间的确定
3.4.5 不同浓度的IPTG对恰塔努加链霉菌生长和纳他霉素产量的影响
3.4.6 梯度控制糖基转移酶ScnK的表达对纳他霉素合成的影响
3.4.7 梯度控制GDP-甘露糖脱氢酶ScnJ的表达对纳他霉素产量的影响
3.4.8 梯度控制氨基转移酶ScnC的表达对纳他霉素产量的影响
3.4.9 梯度控制P450单加氧酶ScnD的表达对纳他霉素产量的影响
3.5 本章小结与讨论
第四章 纳他霉素高速生物合成途径的构建
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株
4.2.2 质粒载体
4.2.3 引物
4.2.4 主要仪器与设备
4.2.5 培养基及培养条件
4.3 实验方法
4.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3
4.3.2 发酵罐发酵培养
4.4 实验结果
4.4.1 系列高表达质粒的构建过程
4.4.2 高表达糖基转移酶基因scnK对纳他霉素产量的影响
4.4.3 高表这P450单加氧酶对纳他霉素产量的影响
4.4.4 高亲达GDP-甘露糖脱水酶和氨基转移酶对纳他霉素产量的影响
4.4.5 组合高表达海藻糖胺合成及转移相关酶对纳他霉素产量的影响
4.4.6 利用两套位点特异性重组体系同时官表达scnK/C和scnZ)
4.4.7 基因重姐菌株在转录水平上的qRT-PC民分析
4.4.8 纳他霉素高产菌株在工业培养基中发酵验证
4.4.9 摇瓶发酵过程中pH值和还原糖浓度的时间曲线
4.4.10 优化pH对纳他霉素产量的影响
4.4.11 优化发酵培养基的萄荀糖浓度W提高纳他霉素的发酵产量
4.4.12 发酵罐小试发酵工艺放大
4.5 本章小结与讨论
第五章 合成途爸与形态分化的协同祝制
5.1 前言
5.2 实验材辑
5.2.1 菌巧
5.2.2 质粒载体
5.2.3 引物
5.2.4 主要仪器与设备
5.2.5 培养基及培养条件
5.2.6 常用试剂
5.3 实验方法
5.3.1 蛋白在大烦巧菌中的异源表达及纯化
5.3.2 凝胶阻滞电泳
5.3.3 DNasel Footprinting
5.3.4 基因患片分析
5.4 实验结栗
5.4.1 WhiG_(ch)序列分析
5.4.2 wWG_(ch)突变株的构建与验证
5.4.3 WhiC_(ch)对形态分化的影口向
5.4.4 WhiG_(ch)对纳他霉素产量的影响
5.4.5 ZJUL31菌株中巧/和内W/的转录水平分析
5.4.6 WhiG_(ch)直接结合到纳他霉素合成基因启动子区
5.4.7 WhiG_(ch)结合序列的确定
5.4.8 转录水平受影响的基因
5.5 本章小结与讨论
第六章 本文研究成果及展望
6.1 本文研究成果
6.2 展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间的主要研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]纳他霉素产生菌的诱变育种及其发酵条件的优化[J]. 阎永贞,魏晓东,那可,金媛媛,赵波,赵文杰. 中国抗生素杂志. 2013(05)
博士论文
[1]恰塔努加链霉菌中纳他霉素生物合成调控机制研究[D]. 杜艺岭.浙江大学 2011
硕士论文
[1]恰塔努加链霉菌纳他霉素生物合成的途径特异性调控机制研究[D]. 孙志豪.浙江大学 2013
[2]恰塔努加链霉菌磷酸双组份系统功能研究[D]. 李善振.浙江大学 2011
[3]纳他霉素高产菌株的构建及其发酵工艺优化[D]. 程良英.浙江大学 2010
本文编号：3171894
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词和术语表
第一章 绪论
1.1 链霉菌的形态发育
1.2 纳他霉素生物合成研究进展
1.2.1 纳他霉素的生物合成基因簇
1.2.2 纳他霉素内酯环合成的起始
1.2.3 纳他霉素内酯环合成的延伸
1.2.4 纳他霉素内酯环的后修饰
1.3 纳他霉素生物合成调控机制
1.3.1 途径特异性调控因子
1.3.2 全局多效调控
1.4 次级代谢产物产量的提高及其代谢酶的研究策略
1.4.1 高表达正相关结构基因
1.4.2 敲除负相关结构基因
1.4.3 体外稳态动力学分析次级代谢酶浓度的适配性
1.4.4 体内分析次级代谢酶的可用诱导型启动子
1.5 本文的研究内容及意义
1.5.1 本文的研究内容
1.5.2 本课题的意义
第二章 纳他霉素合成途径的后修饰机制解析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株
2.2.2 质粒
2.2.3 引物
2.2.4 主要仪器与设备
2.2.5 培养基及培养条件
2.2.6 常用试剂
2.3 实验方法
2.3.1 S.chattanoogensis基因组DNA的抽提
2.3.2 DNA片段的PCR扩增
2.3.3 DNA片断的处理
2.3.4 大肠杆菌质粒抽提
2.3.5 大肠杆菌Cosmid抽提
2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
2.3.8 孢子悬液的制备
2.3.9 S.chattanoogensis和E.coli ET12567的属间接合转导
2.3.10 PCR-targeting基因敲除
2.3.11 S chattanoogensis单交换突变株的获得
2.3.12 S.chattanoogensis双交换突变株的获得
2.3.13 S.chattanoogensis发酵、产物处理、HPLC和ESI-MS检测
2.3.14 RNA的抽提、基因组DNA的消解、反转录及qRT-PCR
2.3.15 纳他霉素生物指示试验
2.4 实验结果
2.4.1 基因缺失株构建与验证
2.4.2 基因缺失株的回补菌株构建与验证
2.4.3 纳他霉素生物合成过程中两个中间代谢产物的鉴定
2.4.4 scnD缺失株产物鉴定
2.4.5 scnK、scnJ和scnC缺失株产物鉴定
2.4.6 scnG缺失株产物鉴定
2.4.7 scnF的缺失导致纳他霉素产量下降
2.4.8 外源糖基转移酶回补scnK缺失株
2.4.9 纳他霉素类似物的抗真菌活性分析
2.5 本章小结与讨论
第三章 纳他霉素高效生物合成的分子机制
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株
3.2.2 质粒
3.2.3 引物
3.2.4 主要仪器与设备
3.2.5 培养基及培养条件
3.2.6 常用试剂
3.3 实验方法
3.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3
3.3.2 链霉菌重组蛋白的表达
3.3.3 链霉菌总蛋白的提取及SDS-PAGE和Western Blot检测
3.4 实验结果
3.4.1 系列诱导载体的构建过程
3.4.2 恰塔努加链霉菌egfp基因体内绿色荧光表达
3.4.3 最佳诱导浓度的确定
3.4.4 最佳诱导剂添加时间的确定
3.4.5 不同浓度的IPTG对恰塔努加链霉菌生长和纳他霉素产量的影响
3.4.6 梯度控制糖基转移酶ScnK的表达对纳他霉素合成的影响
3.4.7 梯度控制GDP-甘露糖脱氢酶ScnJ的表达对纳他霉素产量的影响
3.4.8 梯度控制氨基转移酶ScnC的表达对纳他霉素产量的影响
3.4.9 梯度控制P450单加氧酶ScnD的表达对纳他霉素产量的影响
3.5 本章小结与讨论
第四章 纳他霉素高速生物合成途径的构建
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株
4.2.2 质粒载体
4.2.3 引物
4.2.4 主要仪器与设备
4.2.5 培养基及培养条件
4.3 实验方法
4.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3
4.3.2 发酵罐发酵培养
4.4 实验结果
4.4.1 系列高表达质粒的构建过程
4.4.2 高表达糖基转移酶基因scnK对纳他霉素产量的影响
4.4.3 高表这P450单加氧酶对纳他霉素产量的影响
4.4.4 高亲达GDP-甘露糖脱水酶和氨基转移酶对纳他霉素产量的影响
4.4.5 组合高表达海藻糖胺合成及转移相关酶对纳他霉素产量的影响
4.4.6 利用两套位点特异性重组体系同时官表达scnK/C和scnZ)
4.4.7 基因重姐菌株在转录水平上的qRT-PC民分析
4.4.8 纳他霉素高产菌株在工业培养基中发酵验证
4.4.9 摇瓶发酵过程中pH值和还原糖浓度的时间曲线
4.4.10 优化pH对纳他霉素产量的影响
4.4.11 优化发酵培养基的萄荀糖浓度W提高纳他霉素的发酵产量
4.4.12 发酵罐小试发酵工艺放大
4.5 本章小结与讨论
第五章 合成途爸与形态分化的协同祝制
5.1 前言
5.2 实验材辑
5.2.1 菌巧
5.2.2 质粒载体
5.2.3 引物
5.2.4 主要仪器与设备
5.2.5 培养基及培养条件
5.2.6 常用试剂
5.3 实验方法
5.3.1 蛋白在大烦巧菌中的异源表达及纯化
5.3.2 凝胶阻滞电泳
5.3.3 DNasel Footprinting
5.3.4 基因患片分析
5.4 实验结栗
5.4.1 WhiG_(ch)序列分析
5.4.2 wWG_(ch)突变株的构建与验证
5.4.3 WhiC_(ch)对形态分化的影口向
5.4.4 WhiG_(ch)对纳他霉素产量的影响
5.4.5 ZJUL31菌株中巧/和内W/的转录水平分析
5.4.6 WhiG_(ch)直接结合到纳他霉素合成基因启动子区
5.4.7 WhiG_(ch)结合序列的确定
5.4.8 转录水平受影响的基因
5.5 本章小结与讨论
第六章 本文研究成果及展望
6.1 本文研究成果
6.2 展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间的主要研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]纳他霉素产生菌的诱变育种及其发酵条件的优化[J]. 阎永贞,魏晓东,那可,金媛媛,赵波,赵文杰. 中国抗生素杂志. 2013(05)
博士论文
[1]恰塔努加链霉菌中纳他霉素生物合成调控机制研究[D]. 杜艺岭.浙江大学 2011
硕士论文
[1]恰塔努加链霉菌纳他霉素生物合成的途径特异性调控机制研究[D]. 孙志豪.浙江大学 2013
[2]恰塔努加链霉菌磷酸双组份系统功能研究[D]. 李善振.浙江大学 2011
[3]纳他霉素高产菌株的构建及其发酵工艺优化[D]. 程良英.浙江大学 2010
本文编号：3171894
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