超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究
发布时间：2021-07-08 20:53
类病毒颗粒（Virus-like particles, VLPs）是一类用于传染性疾病预防的重要新型疫苗,有效的分离纯化是确保其安全性和有效性的关键。色谱分离是生物大分子分离纯化最主要的技术,商品化的色谱填料主要是为常规蛋白质设计,孔道一般小于30nm,而VLPs通常由上百个亚基组装而成,尺寸在20～100 nm,因此其在传统填料中的扩散速率慢,甚至会堵塞孔道,导致分离时间过长,以及产物在操作中大量失活。为此,本论文研究孔径达到100 nm以上的新型超大孔色谱填料在乙肝表面抗原类病毒颗粒（Hepatitis B virus surface antigenVLPs, HB-VLPs）分离纯化中的应用,通过与其他类型色谱填料对比,对超大孔填料色谱分离VLPs的过程特点进行了如下系统的研究：（1）选取具有不用孔径的两种琼脂糖填料（DEAE-FF、DEAE-Capto）,四种超大孔填料（DEAE-AP-120nm、DEAE-AP-280nm、POROS D和POROSHQ）,以及一种整体柱类型的阴离子交换色谱填料,首先考察了孔径对不同尺寸的蛋白质动态载量的影响,发现小孔径的琼脂糖填料对较小尺寸...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)北京市
【文章页数】：191 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 色谱技术在病毒和类病毒颗粒纯化中的应用
1.1.1 色谱技术纯化病毒、类病毒颗粒的难点
1.1.2 色谱技术纯化病毒、类病毒颗粒的解决方法
1.2 超大孔色谱分离填料
1.2.1 色谱分离填料发展历程
1.2.2 超大孔色谱分离填料的优势
1.2.3 超大孔色谱分离填料的种类以及应用
1.2.4 超大孔填料分离纯化病毒、类病毒颗粒的研究现状
1.3 蛋白质构象变化研究
1.3.1 蛋白质在色谱分离中的构象变化的影响因素
1.3.2 超大分子VLPs在色谱中构象变化的研究
1.3.3 超大孔填料提高蛋白质在色谱中的构象稳定性
1.4 蛋白质色谱过程中构象研究方法
1.4.1 蛋白色谱过程中的热力学特征
1.4.1.1 热力学基本原理
1.4.1.2 蛋白质与色谱间相互作用对热力学参数的影响
1.4.2 蛋白质色谱过程中的热力学研究方法
1.4.2.1 Van't Hoff方程分析法
1.4.2.2 等温滴定量热法
1.5 超大孔填料分离纯化疫苗的研究展望
1.6 本文研究内容和意义
2 适合于类病毒颗粒分离纯化的色谱填料筛选
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 离子交换色谱填料的表征
2.2.2 动态结合载量
2.2.3 HB-VLPs的离子交换色谱
2.2.4 酶联免疫法和高效液相色谱法分析HB-VLPs
2.2.5 从重组汉逊酵母培养液中纯化HB-VLPs
2.2.6 HB-VLPs纯度检测
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 色谱填料的基本物性
2.3.2 离子交换填料孔径对不同分子量蛋白动态载量的影响
2.3.3 蛋白在阴离子交换填料上的分离效果
2.3.4 流速对于HB-VLPs色谱过程中回收率和结构的影响
2.3.5 洗脱盐类型对于HB-VLPs回收率和结构的影响
2.3.6 HB-VLPs的实际纯化
2.4 本章小结
3 填料孔径对蛋白质色谱性质影响的规律研究
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 逆体积色谱法测定填料可及孔隙体积和表观孔径
3.2.2 等度洗脱
3.2.3 吸附平衡实验
3.2.4 吸附动力学
3.2.5 动态结合载量
3.2.6 激光共聚焦
3.3 实验结果与讨论
3.3.1 蛋白和填料的基本物性
3.3.2 逆体积排阻色谱法对IEC填料孔径结构进行表征
3.3.3 可及比表面积随IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.4 静态吸附载量随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.5 吸附解离常数随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.6 吸附动力学随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.7 动态载量随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.8 根据CLSM观测研究蛋白质在IEC填料上的吸附动力学
3.4 本章小结
4 超大孔离子交换填料提高类病毒颗粒的载量和稳定性
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 定性离子交换填料
4.2.2 吸附平衡实验
4.2.3 动态结合载量
4.2.4 吸附动力学
4.2.5 激光共聚焦
4.2.6 不同进料量的HB-VLPs的离子交换色谱
4.2.7 酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法分析HB-VLPs
4.2.8 透射电子显微镜法(TEM)分析
4.2.9 从重组汉逊酵母培养液中纯化HB-VLPs
4.2.10 HB-VLPs纯度检测
4.3 实验结果
4.3.1 离子交换填料孔径大小对于HB-VLPs吸附平衡的影响
4.3.1.1 HB-VLPs在不同孔径填料上的静态载量
4.3.1.2 激光共聚焦显示孔径大小对于HB-VLPs吸附的影响
4.3.2 IEC填料孔径大小对于吸附动力学的影响
4.3.3 IEC填料孔径大小对于HB-VLPs动态载量的影响
4.3.4 IEC填料孔径大小对于HB-VLPs色谱过程中回收率和结构的影响
4.3.4.1 进料量对于HB-VLPs回收率和结构的影响
4.3.4.2 相同进料量孔径大小对于HB-VLPs回收率和结构的影响
4.3.5 HB-VLPs在四种填料上的实际纯化
4.4 本章小结
5 超大孔填料促进HB-VLPs纯化过程中结构稳定性的热力学机理研究
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.2.1 离子交换色谱填料的定性
5.2.2 HB-VLPs完整颗粒在不同孔径填料上的离子交换色谱
5.2.3 酶联免疫分析和高效液相色谱法分析HB-VLPs
5.2.4 HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体的定性
5.2.5 不同孔径填料上的吸附平衡实验
5.2.6 ITC实验：HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体
5.3 实验结果与讨论
5.3.1 色谱实验检测蛋白结构变化
5.3.1.1 IEC填料的孔径对于HB-VLPs抗原回收率的影响
5.3.1.2 IEC填料的孔径对于HB-VLPs结构的影响
5.3.1.3 圆二色谱(CD)
5.3.2 孔径对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附平衡的影响
5.3.3 等温滴定量热实验研究
5.3.3.1 吸附热力学模型的建立
5.3.3.2 HB-VLPs完整颗粒和解聚体的ITC实验确定模型参数
5.3.3.3 孔径对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附焓变的影响
5.3.3.4 关于ITC热力学参数的进一步分析和讨论
5.4 本章小结
6 超大孔填料配基密度影响HB-VLPs结构稳定性的热力学机理研究
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.2.1 制备不同配基密度的阴离子交换填料
6.2.2 离子交换色谱填料的性能测定
6.2.3 HB-VLPs在不同配基密度填料上的离子交换色谱
6.2.4 酶联免疫分析和高效液相色谱法分析HB-VLPs
6.2.5 HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体的定性
6.2.6 不同配基密度填料上的吸附平衡实验
6.2.7 ITC实验：HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体
6.3 实验结果与讨论
6.3.1 色谱实验检测蛋白结构变化
6.3.1.1 IEC填料配基密度对于HB-VLPs抗原回收率的影响
6.3.1.2 IEC填料的配基密度对于HB-VLPs结构的影响
6.3.1.3 圆二色谱(CD)
6.3.2 配基密度对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附平衡的影响
6.3.3 等温滴定量热实验
6.3.3.1 热力学模型阐明色谱过程HB-VLPs解聚体的形成
6.3.3.2 ITC实验确定模型参数
6.3.3.3 配基密度对IEC中HB-VLPs完整颗粒构象变化焓变的影响
6.3.4 关于ITC热力学参数的进一步分析和讨论
6.3.5 溶菌酶与不同配基密度填料相互作用的热力学
6.4 本章小结
7 结论与展望
7.1 本文的研究结果
7.2 本文的创新点
7.3 展望
符号表
参考文献
附录 A图目录
附录 B表目录
个人简历及发表文章目录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]超大孔聚（苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯）共聚微球的制备及孔结构的调控[J]. 李燕,周炜清,马光辉. 过程工程学报. 2010(03)
[2]逆体积排阻层析法测定层析介质的孔径分布[J]. 沈醉,林东强,姚善泾. 化工学报. 2010(04)
[3]自组装磁性聚苯乙烯微球固定化木瓜蛋白酶[J]. 王秋雨,钦传光,张秋禹,赵雯,张瑞洁,李阳. 应用化学. 2009(05)
[4]间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响[J]. 李瑞红,李岩,闭静秀,赵岚,周卫斌,黄永东,张焱,孙李靖,王化军,苏志国. 生物工程学报. 2007(04)
[5]大孔载体制备及其固定化脂肪酶[J]. 蔡宏举,王满意,周鑫,谭天伟. 化工学报. 2007(06)
[6]聚合物基质高效液相色谱填料在白细胞介素-2分离中的应用[J]. 魏荣卿,张婷婷,邵勇军,刘晓宁. 分析化学. 2007(04)
[7]禽流感病毒神经氨酸酶的结构及其生物学功能[J]. 王全英,乔传玲,申之义. 动物医学进展. 2005(12)
[8]禽流感病毒血凝素分子生物学研究进展[J]. 曹梅,田夫林,庄文忠. 动物医学进展. 2004(02)
[9]压汞法研究大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂的孔结构.Ⅴ.汞接触角和表面张力对孔结构的影响[J]. 郭贤权,王补森,何炳林. 离子交换与吸附. 1990(02)
博士论文
[1]流通色谱介质的研制和生物大分子色谱分离[D]. 孙国勇.天津大学 2005
本文编号：3272316
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)北京市
【文章页数】：191 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 色谱技术在病毒和类病毒颗粒纯化中的应用
1.1.1 色谱技术纯化病毒、类病毒颗粒的难点
1.1.2 色谱技术纯化病毒、类病毒颗粒的解决方法
1.2 超大孔色谱分离填料
1.2.1 色谱分离填料发展历程
1.2.2 超大孔色谱分离填料的优势
1.2.3 超大孔色谱分离填料的种类以及应用
1.2.4 超大孔填料分离纯化病毒、类病毒颗粒的研究现状
1.3 蛋白质构象变化研究
1.3.1 蛋白质在色谱分离中的构象变化的影响因素
1.3.2 超大分子VLPs在色谱中构象变化的研究
1.3.3 超大孔填料提高蛋白质在色谱中的构象稳定性
1.4 蛋白质色谱过程中构象研究方法
1.4.1 蛋白色谱过程中的热力学特征
1.4.1.1 热力学基本原理
1.4.1.2 蛋白质与色谱间相互作用对热力学参数的影响
1.4.2 蛋白质色谱过程中的热力学研究方法
1.4.2.1 Van't Hoff方程分析法
1.4.2.2 等温滴定量热法
1.5 超大孔填料分离纯化疫苗的研究展望
1.6 本文研究内容和意义
2 适合于类病毒颗粒分离纯化的色谱填料筛选
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 离子交换色谱填料的表征
2.2.2 动态结合载量
2.2.3 HB-VLPs的离子交换色谱
2.2.4 酶联免疫法和高效液相色谱法分析HB-VLPs
2.2.5 从重组汉逊酵母培养液中纯化HB-VLPs
2.2.6 HB-VLPs纯度检测
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 色谱填料的基本物性
2.3.2 离子交换填料孔径对不同分子量蛋白动态载量的影响
2.3.3 蛋白在阴离子交换填料上的分离效果
2.3.4 流速对于HB-VLPs色谱过程中回收率和结构的影响
2.3.5 洗脱盐类型对于HB-VLPs回收率和结构的影响
2.3.6 HB-VLPs的实际纯化
2.4 本章小结
3 填料孔径对蛋白质色谱性质影响的规律研究
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 逆体积色谱法测定填料可及孔隙体积和表观孔径
3.2.2 等度洗脱
3.2.3 吸附平衡实验
3.2.4 吸附动力学
3.2.5 动态结合载量
3.2.6 激光共聚焦
3.3 实验结果与讨论
3.3.1 蛋白和填料的基本物性
3.3.2 逆体积排阻色谱法对IEC填料孔径结构进行表征
3.3.3 可及比表面积随IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.4 静态吸附载量随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.5 吸附解离常数随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.6 吸附动力学随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.7 动态载量随着IEC填料的孔径与蛋白大小比的变化
3.3.8 根据CLSM观测研究蛋白质在IEC填料上的吸附动力学
3.4 本章小结
4 超大孔离子交换填料提高类病毒颗粒的载量和稳定性
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 定性离子交换填料
4.2.2 吸附平衡实验
4.2.3 动态结合载量
4.2.4 吸附动力学
4.2.5 激光共聚焦
4.2.6 不同进料量的HB-VLPs的离子交换色谱
4.2.7 酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法分析HB-VLPs
4.2.8 透射电子显微镜法(TEM)分析
4.2.9 从重组汉逊酵母培养液中纯化HB-VLPs
4.2.10 HB-VLPs纯度检测
4.3 实验结果
4.3.1 离子交换填料孔径大小对于HB-VLPs吸附平衡的影响
4.3.1.1 HB-VLPs在不同孔径填料上的静态载量
4.3.1.2 激光共聚焦显示孔径大小对于HB-VLPs吸附的影响
4.3.2 IEC填料孔径大小对于吸附动力学的影响
4.3.3 IEC填料孔径大小对于HB-VLPs动态载量的影响
4.3.4 IEC填料孔径大小对于HB-VLPs色谱过程中回收率和结构的影响
4.3.4.1 进料量对于HB-VLPs回收率和结构的影响
4.3.4.2 相同进料量孔径大小对于HB-VLPs回收率和结构的影响
4.3.5 HB-VLPs在四种填料上的实际纯化
4.4 本章小结
5 超大孔填料促进HB-VLPs纯化过程中结构稳定性的热力学机理研究
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.2.1 离子交换色谱填料的定性
5.2.2 HB-VLPs完整颗粒在不同孔径填料上的离子交换色谱
5.2.3 酶联免疫分析和高效液相色谱法分析HB-VLPs
5.2.4 HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体的定性
5.2.5 不同孔径填料上的吸附平衡实验
5.2.6 ITC实验：HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体
5.3 实验结果与讨论
5.3.1 色谱实验检测蛋白结构变化
5.3.1.1 IEC填料的孔径对于HB-VLPs抗原回收率的影响
5.3.1.2 IEC填料的孔径对于HB-VLPs结构的影响
5.3.1.3 圆二色谱(CD)
5.3.2 孔径对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附平衡的影响
5.3.3 等温滴定量热实验研究
5.3.3.1 吸附热力学模型的建立
5.3.3.2 HB-VLPs完整颗粒和解聚体的ITC实验确定模型参数
5.3.3.3 孔径对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附焓变的影响
5.3.3.4 关于ITC热力学参数的进一步分析和讨论
5.4 本章小结
6 超大孔填料配基密度影响HB-VLPs结构稳定性的热力学机理研究
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.2.1 制备不同配基密度的阴离子交换填料
6.2.2 离子交换色谱填料的性能测定
6.2.3 HB-VLPs在不同配基密度填料上的离子交换色谱
6.2.4 酶联免疫分析和高效液相色谱法分析HB-VLPs
6.2.5 HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体的定性
6.2.6 不同配基密度填料上的吸附平衡实验
6.2.7 ITC实验：HB-VLPs完整颗粒和HB-VLPs解聚体
6.3 实验结果与讨论
6.3.1 色谱实验检测蛋白结构变化
6.3.1.1 IEC填料配基密度对于HB-VLPs抗原回收率的影响
6.3.1.2 IEC填料的配基密度对于HB-VLPs结构的影响
6.3.1.3 圆二色谱(CD)
6.3.2 配基密度对于HB-VLPs完整颗粒和解聚体吸附平衡的影响
6.3.3 等温滴定量热实验
6.3.3.1 热力学模型阐明色谱过程HB-VLPs解聚体的形成
6.3.3.2 ITC实验确定模型参数
6.3.3.3 配基密度对IEC中HB-VLPs完整颗粒构象变化焓变的影响
6.3.4 关于ITC热力学参数的进一步分析和讨论
6.3.5 溶菌酶与不同配基密度填料相互作用的热力学
6.4 本章小结
7 结论与展望
7.1 本文的研究结果
7.2 本文的创新点
7.3 展望
符号表
参考文献
附录 A图目录
附录 B表目录
个人简历及发表文章目录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]超大孔聚（苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯）共聚微球的制备及孔结构的调控[J]. 李燕,周炜清,马光辉. 过程工程学报. 2010(03)
[2]逆体积排阻层析法测定层析介质的孔径分布[J]. 沈醉,林东强,姚善泾. 化工学报. 2010(04)
[3]自组装磁性聚苯乙烯微球固定化木瓜蛋白酶[J]. 王秋雨,钦传光,张秋禹,赵雯,张瑞洁,李阳. 应用化学. 2009(05)
[4]间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响[J]. 李瑞红,李岩,闭静秀,赵岚,周卫斌,黄永东,张焱,孙李靖,王化军,苏志国. 生物工程学报. 2007(04)
[5]大孔载体制备及其固定化脂肪酶[J]. 蔡宏举,王满意,周鑫,谭天伟. 化工学报. 2007(06)
[6]聚合物基质高效液相色谱填料在白细胞介素-2分离中的应用[J]. 魏荣卿,张婷婷,邵勇军,刘晓宁. 分析化学. 2007(04)
[7]禽流感病毒神经氨酸酶的结构及其生物学功能[J]. 王全英,乔传玲,申之义. 动物医学进展. 2005(12)
[8]禽流感病毒血凝素分子生物学研究进展[J]. 曹梅,田夫林,庄文忠. 动物医学进展. 2004(02)
[9]压汞法研究大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂的孔结构.Ⅴ.汞接触角和表面张力对孔结构的影响[J]. 郭贤权,王补森,何炳林. 离子交换与吸附. 1990(02)
博士论文
[1]流通色谱介质的研制和生物大分子色谱分离[D]. 孙国勇.天津大学 2005
本文编号：3272316
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/gckjbs/3272316.html
