水稻α-半乳糖苷酶的热稳定性改造及催化机制研究
发布时间：2021-08-17 05:30
α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-Gal,EC 3.2.1.22）能专一性催化半乳低聚糖、多糖、糖脂及糖蛋白中α-1,6-半乳糖苷键的水解,在食品、饲料、医药及轻工业等领域具有广泛的应用,因此近年来对它的研究较多。但是α-Gal存在热稳定性差、催化效率低等问题,同时较低的产量也限制了其应用。构建出热稳定性良好、比酶活高、表达量高的α-Gal基因工程菌具有重要的研究意义。本研究成功地将源于水稻（Oryza sativa L.subsp.japonica var.Nipponbare）的riceα-Gal II基因通过a-凝集素锚定表达于酿酒酵母细胞表面,得到酿酒酵母表面展示（Yeast Surface Display,YSD）的全细胞催化单元YSD riceα-Gal II。省略了酶蛋白分离纯化的步骤;优化培养基组分及连续补料发酵提高了单位细胞表达的酶活力、细胞干重和总产量;优势辅因子的加入使表面展示基因工程菌的活性和稳定性进一步提高;通过理性设计、分子动力学模拟解析影响酶热稳定性的关键功能氨基酸位点,对拟突变体进行分子动力学二次模拟筛选得到热稳定性良好的α-Gal突变...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
pYD1载体原理图
沈阳农业大学博士学位论文19分子改造位点，进行单点突变、N-端截短、loop区截短的拟突变体的二次分子动力学模拟预测，选择正向突变体进行实际突变，获得热稳定性提高的riceα-GalII。（4）采用半柔性分子对接解析同源建模模板riceα-GalI、riceα-GalII及其突变体与不同底物的结合形式，进一步阐明酶的催化机制。1.5技术路线图1-2技术路线Figure1-2Thetechnicalrouteofthisstudy
沈阳农业大学博士学位论文27图2-1基于pYD1系统的riceα-GalII酿酒酵母表面展示。（A）YSDriceα-GalII的免疫荧光染色，（B）YSDriceα-GalII的SDS-PAGE，Lane1为蛋白分子量，Lane2为EBY100，Lane3为EBY100/pYD1，Lane4为YSDriceα-GalIIFig2-1Yeastsurfacedisplayedriceα-GalIIbasedonpYD1system.(A)ImmunofluorescencestainingofYSDriceα-GalII,(B)ExpressionpatternoftheYSDriceα-GalIIdetectedbySDS-PAGE,Lane1,molecularmaker;Lane2,EBY100;Lane3,EBY100/pYD1;Lane4,YSDriceα-GalII2.2.2氮源对YSDriceα-GalII表达的影响氮源是蛋白质和遗传物质核酸合成的重要原料，参与微生物细胞自身蛋白和代谢产物构成，分为有机氮源和无机氮源，选择合适的氮源对酶的表达和菌体质量的提高均十分重要。不同氮源对YSDriceα-GalII表达的影响见图2-2A，精氨酸对YSDriceα-GalII的表达活性有明显（p≤0.05）的抑制作用，尽管细胞干重显著增加，但最终得到酶的总产量仍然大幅减少。而添加硫酸铵和尿素均显著提高了酶的总产量（p≤0.05）。其中硫酸铵主要促进了酵母细胞的生长，表现为细胞干重的显著增加（p≤0.05），虽然酶活性略有降低，但总产量增加显著。在酿酒酵母表达有机磷水解酶的研究中也发现了类似
【参考文献】：
期刊论文
[1](S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响[J]. 杨倩,穆星,刘会云,向英,李振秋. 北京农学院学报. 2020(01)
[2]酿酒酵母工程菌发酵产青蒿酸的工艺优化[J]. 于文文,陈伟,滕云,陈亚军,徐美冬,杨胜利. 精细化工. 2019(05)
[3]微生物α-半乳糖苷酶的研究进展[J]. 闫巧娟,刘瑜,江正强. 微生物学杂志. 2017(03)
[4]几种多元醇对橡胶籽β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响[J]. 王珂,张烨,刘石生,彭婉莹,董文歆. 食品工业. 2017(04)
[5]α-半乳糖苷酶固定化的研究进展[J]. 解婉莹,董墨思,李苏红. 粮油食品科技. 2016(03)
[6]α-半乳糖苷酶的催化机理及底物特异性[J]. 李楠,李苏红,徐杰,李润国,董墨思. 粮油食品科技. 2014(03)
[7]α-半乳糖苷酶的研究进展[J]. 郝桂娟,张凯,王学智,张景艳,孟嘉仁,杨志强,李建喜. 中国畜牧兽医. 2013(03)
[8]Identification of an intestine-specific promoter and inducible expression of bacterial α-galactosidase in mammalian cells by a lac operon system[J]. Zhai Ya-Feng,Shu Gang,Zhu Xiao-Tong,Zhang Zhi-Qi,Lin Xia-Jing,Wang Song-Bo,Wang Li-Na,Zhang Yong-Liang,Jiang Qing-Yan. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2013(01)
[9]新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面αGal抗原的研究[J]. 高红伟,张雪,李素波,檀英霞,鲍国强,王颖丽,徐丽娟,季守平,宫锋. 中国实验血液学杂志. 2012(05)
[10]L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究[J]. 范向东,孙在柏. 化学与生物工程. 2010(10)
博士论文
[1]类芽孢杆菌甲壳素酶的酶学性质、热稳定性改造及应用研究[D]. 徐培.华南理工大学 2019
[2]计算机辅助分子设计提高蛋白质热稳定性的研究[D]. 田健.中国农业科学院 2011
[3]药物分子对接优化模型与算法研究[D]. 康玲.大连理工大学 2009
硕士论文
[1]瓜尔胶基水凝胶的制备及其在柔性夹爪机器人中的应用探索[D]. 刘传杰.曲阜师范大学 2019
[2]耐热α-半乳糖苷酶的克隆表达及性质研究[D]. 蒋晓芳.武汉轻工大学 2019
[3]基于化学修饰及分子改造提高肌酸酶的稳定性[D]. 高亚楠.江南大学 2017
[4]活性位点邻近的Ω-loop对胰蛋白酶热稳定性和活性的影响[D]. 杜坤.天津大学 2017
[5]通过N-端置换及定点突变提高木聚糖酶AoXyn11A耐热性的研究[D]. 何瑶.江南大学 2016
[6]α-半乳糖苷酶Aga2晶体结构及八氢番茄红素脱氢酶CrtIRa结晶条件研究[D]. 谭小芳.山东大学 2016
[7]表面展示外源蛋白的毕赤酵母细胞壁蛋白抽提及分析[D]. 周新莹.华南理工大学 2012
[8]酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的发酵工艺研究[D]. 段晓娟.华中科技大学 2011
[9]计算机辅助抗癌药物设计和蛋白同源建模研究[D]. 黄晓艳.兰州大学 2011
本文编号：3347156
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
pYD1载体原理图
沈阳农业大学博士学位论文19分子改造位点，进行单点突变、N-端截短、loop区截短的拟突变体的二次分子动力学模拟预测，选择正向突变体进行实际突变，获得热稳定性提高的riceα-GalII。（4）采用半柔性分子对接解析同源建模模板riceα-GalI、riceα-GalII及其突变体与不同底物的结合形式，进一步阐明酶的催化机制。1.5技术路线图1-2技术路线Figure1-2Thetechnicalrouteofthisstudy
沈阳农业大学博士学位论文27图2-1基于pYD1系统的riceα-GalII酿酒酵母表面展示。（A）YSDriceα-GalII的免疫荧光染色，（B）YSDriceα-GalII的SDS-PAGE，Lane1为蛋白分子量，Lane2为EBY100，Lane3为EBY100/pYD1，Lane4为YSDriceα-GalIIFig2-1Yeastsurfacedisplayedriceα-GalIIbasedonpYD1system.(A)ImmunofluorescencestainingofYSDriceα-GalII,(B)ExpressionpatternoftheYSDriceα-GalIIdetectedbySDS-PAGE,Lane1,molecularmaker;Lane2,EBY100;Lane3,EBY100/pYD1;Lane4,YSDriceα-GalII2.2.2氮源对YSDriceα-GalII表达的影响氮源是蛋白质和遗传物质核酸合成的重要原料，参与微生物细胞自身蛋白和代谢产物构成，分为有机氮源和无机氮源，选择合适的氮源对酶的表达和菌体质量的提高均十分重要。不同氮源对YSDriceα-GalII表达的影响见图2-2A，精氨酸对YSDriceα-GalII的表达活性有明显（p≤0.05）的抑制作用，尽管细胞干重显著增加，但最终得到酶的总产量仍然大幅减少。而添加硫酸铵和尿素均显著提高了酶的总产量（p≤0.05）。其中硫酸铵主要促进了酵母细胞的生长，表现为细胞干重的显著增加（p≤0.05），虽然酶活性略有降低，但总产量增加显著。在酿酒酵母表达有机磷水解酶的研究中也发现了类似
【参考文献】：
期刊论文
[1](S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响[J]. 杨倩,穆星,刘会云,向英,李振秋. 北京农学院学报. 2020(01)
[2]酿酒酵母工程菌发酵产青蒿酸的工艺优化[J]. 于文文,陈伟,滕云,陈亚军,徐美冬,杨胜利. 精细化工. 2019(05)
[3]微生物α-半乳糖苷酶的研究进展[J]. 闫巧娟,刘瑜,江正强. 微生物学杂志. 2017(03)
[4]几种多元醇对橡胶籽β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响[J]. 王珂,张烨,刘石生,彭婉莹,董文歆. 食品工业. 2017(04)
[5]α-半乳糖苷酶固定化的研究进展[J]. 解婉莹,董墨思,李苏红. 粮油食品科技. 2016(03)
[6]α-半乳糖苷酶的催化机理及底物特异性[J]. 李楠,李苏红,徐杰,李润国,董墨思. 粮油食品科技. 2014(03)
[7]α-半乳糖苷酶的研究进展[J]. 郝桂娟,张凯,王学智,张景艳,孟嘉仁,杨志强,李建喜. 中国畜牧兽医. 2013(03)
[8]Identification of an intestine-specific promoter and inducible expression of bacterial α-galactosidase in mammalian cells by a lac operon system[J]. Zhai Ya-Feng,Shu Gang,Zhu Xiao-Tong,Zhang Zhi-Qi,Lin Xia-Jing,Wang Song-Bo,Wang Li-Na,Zhang Yong-Liang,Jiang Qing-Yan. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2013(01)
[9]新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面αGal抗原的研究[J]. 高红伟,张雪,李素波,檀英霞,鲍国强,王颖丽,徐丽娟,季守平,宫锋. 中国实验血液学杂志. 2012(05)
[10]L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究[J]. 范向东,孙在柏. 化学与生物工程. 2010(10)
博士论文
[1]类芽孢杆菌甲壳素酶的酶学性质、热稳定性改造及应用研究[D]. 徐培.华南理工大学 2019
[2]计算机辅助分子设计提高蛋白质热稳定性的研究[D]. 田健.中国农业科学院 2011
[3]药物分子对接优化模型与算法研究[D]. 康玲.大连理工大学 2009
硕士论文
[1]瓜尔胶基水凝胶的制备及其在柔性夹爪机器人中的应用探索[D]. 刘传杰.曲阜师范大学 2019
[2]耐热α-半乳糖苷酶的克隆表达及性质研究[D]. 蒋晓芳.武汉轻工大学 2019
[3]基于化学修饰及分子改造提高肌酸酶的稳定性[D]. 高亚楠.江南大学 2017
[4]活性位点邻近的Ω-loop对胰蛋白酶热稳定性和活性的影响[D]. 杜坤.天津大学 2017
[5]通过N-端置换及定点突变提高木聚糖酶AoXyn11A耐热性的研究[D]. 何瑶.江南大学 2016
[6]α-半乳糖苷酶Aga2晶体结构及八氢番茄红素脱氢酶CrtIRa结晶条件研究[D]. 谭小芳.山东大学 2016
[7]表面展示外源蛋白的毕赤酵母细胞壁蛋白抽提及分析[D]. 周新莹.华南理工大学 2012
[8]酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的发酵工艺研究[D]. 段晓娟.华中科技大学 2011
[9]计算机辅助抗癌药物设计和蛋白同源建模研究[D]. 黄晓艳.兰州大学 2011
本文编号：3347156
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/gckjbs/3347156.html
