硫酸化寡糖与多糖的质谱分析研究

发布时间：2021-08-22 09:29

　　硫酸化寡糖和多糖广泛存在于自然界中,具有多种生物活性,如抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抑菌和增强机体免疫等。但是硫酸化寡糖和多糖带有大量的负电荷,极性强,其分析检测及制备较为困难。本文采用衍生化策略,以质谱、液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术为手段,详细分析了酶降解得到的卡拉胶寡糖片段的结构,并系统比较了不同降解方法得到的卡拉胶寡糖的结构和抗氧化活性；发展了多糖硫酸化位点测定的新方法,为研究硫酸化寡糖和多糖结构与功能的关系奠定了基础。本文得到了以下主要结果：1、系统研究了新型κ-卡拉胶酶的降解机制,并对其降解所得的硫酸化κ-卡拉胶寡糖产物的组成和结构序列进行了分析。从土壤杆菌Pedobacter hainanensis的培养液中分离纯化得到了新型κ-卡拉胶酶。经过SDS-PAGE检测其分子量约为55 kDa,在最适条件下（pH 7.0,40℃）其最高相对酶活力为700.53 units/mg。用该酶降解κ-卡拉胶,所得的产物用TLC和HPLC分析,结果表明,该酶降解的产物是一系列聚合度为偶数的卡拉胶寡糖,其中四糖占主要成分。利用ESI-MS技术对不同时间获得的酶解产物进... 

【文章来源】：西北大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：146 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1、硫酸化多糖及其生物活性
        1.1 动物来源的硫酸化多糖
        1.2 海洋藻类来源的硫酸化多糖
    2、卡拉胶及其寡糖的研究进展
        2.1 卡拉胶的结构
        2.2 卡拉胶寡糖及其制备方法
        2.3 卡拉胶寡糖的生物作用
    3、糖类物质的硫酸化修饰
    4、硫酸化糖类物质结构研究的现状及发展趋势
    5、本论文研究的目的和意义
第二章 新型酶降解κ-卡拉胶及其寡糖产物的分析和制备研究
    1、实验部分
        1.1 实验材料、试剂和仪器
            1.1.1 实验材料
            1.1.2 实验试剂
            1.1.3 实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 菌株的活化和培养
            1.2.2 κ-卡拉胶酶的分离纯化
            1.2.3 κ-卡拉胶酶的相对酶活力
                1.2.3.1 κ-卡拉胶酶活力的测定
                1.2.3.2 κ-卡拉胶酶蛋白含量的测定
                1.2.3.3 κ-卡拉胶酶相对酶活力的评价
            1.2.4 κ-卡拉胶酶的底物特异性研究
            1.2.5 κ-卡拉胶酶分子量的测定
            1.2.6 κ-卡拉胶寡糖的酶法制备
            1.2.7 酶降解κ-卡拉胶寡糖的TLC分析
            1.2.8 酶降解κ-卡拉胶寡糖的HPLC分析
                1.2.8.1 κ-卡拉胶寡糖的AEC衍生化标记
                1.2.8.2 标记产物的HPLC分析
            1.2.9 酶降解κ-卡拉胶寡糖醇的制备
            1.2.10 ESI-MS和CID MS/MS分析
    2、实验结果和讨论
        2.1 κ-卡拉胶酶的分离纯化
        2.2 κ-卡拉胶酶的相对酶活力
        2.3 κ-卡拉胶酶的底物特异性
        2.4 κ-卡拉胶酶的分子量
        2.5 酶降解κ-卡拉胶寡糖的TLC分析结果
        2.6 酶降解κ-卡拉胶寡糖的ESI-MS分析结果
        2.7 酶降解κ-卡拉胶寡糖的HPLC分析结果
            2.7.1 酶降解κ-卡拉胶寡糖与AEC的衍生
            2.7.2 不同聚合度κ-卡拉胶寡糖的定量分析
        2.8 酶降解κ-卡拉胶寡糖的CID MS/MS分析结果
            2.8.1 κ-卡拉胶寡糖醇的制备
            2.8.2 κ-卡拉胶寡糖的序列分析
        2.9 κ-卡拉胶酶酶切位点的确定
    3、本章小结
第三章 不同方法对κ-卡拉胶的降解及其寡糖产物的结构和抗氧化活性研究
    1、实验部分
        1.1 实验材料、试剂和仪器
            1.1.1 实验材料
            1.1.2 实验试剂
            1.1.3 实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 不同降解方法制备κ-卡拉胶寡糖
                1.2.1.1 自由基氧化降解
                1.2.1.2 温和酸水解
                1.2.1.3 酶降解
                1.2.1.4 部分还原性水解
            1.2.2 降解产物还原糖含量的测定
            1.2.3 降解产物硫酸基含量的测定
            1.2.4 ESI-MS和CID MS/MS分析
            1.2.5 κ-卡拉胶寡糖抗氧化活性的研究
                1.2.5.1 对超氧阴离子清除能力的评估
                1.2.5.2 对羟自由基清除能力的评估
                1.2.5.3 还原能力的评估
                1.2.5.4 对DPPH自由基清除能力的评估
            1.2.6 κ-卡拉胶寡糖的细胞内抗氧化活性的评估
                1.2.6.1 人肝癌细胞HepG2的培养
                1.2.6.2 细胞内抗氧化活性的测定
    2、实验结果和讨论
        2.1 κ-卡拉胶寡糖的制备
            2.1.1 还原糖含量的比较
            2.1.2 κ-卡拉胶寡糖产率的比较
            2.1.3 硫酸基含量的比较
        2.2 κ-卡拉胶寡糖的ESI-MS和CID MS/MS分析结果
            2.2.1 H_2O_2降解
            2.2.2 HCl水解
            2.2.3 κ-卡拉胶酶降解
            2.2.4 部分还原性水解
        2.3 κ-卡拉胶寡糖抗氧化活性的比较
            2.3.1 对超氧阴离子的清除能力
            2.3.2 对羧自由基的清除能力
            2.3.3 还原能力
            2.3.4 对DPPH自由基的清除能力
        2.4 K-卡拉胶實糖的细胞内抗氧化活性
    3、本章小结
第四章 GC-MS用于多糖硫酸化位点分析的新方法研究
    1、实验部分
        1.1 实验材料、试剂和仪器
            1.1.1 实验材料
            1.1.2 实验试剂
            1.1.3 实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 枸杞多糖LbGp1-OL的提取和分离纯化
            1.2.2 枸杞多糖LbGp1-OL的硫酸化修饰
            1.2.3 总糖含量的测定
            1.2.4 硫酸基含量的测定
            1.2.5 相对分子质量的测定
            1.2.6 红外光谱分析
            1.2.7 部分酸水解
            1.2.8 单糖组成的定量分析
            1.2.9 甲基化
            1.2.10 脱硫酸基
            1.2.11 GC-MS分析
    2、实验结果和讨论
        2.1 枸杞多糖LbGp1-OL的分离纯化
        2.2 硫酸化枸杞多糖LbGp1-OL-SL和LbGp1-OL-SH的制备
        2.3 LbGp1-OL、LbGp1-OL-SL和LbGp1-OL-SH理化性质的比较
            2.3.1 总糖含量的比较
            2.3.2 硫酸基含量的比较
            2.3.3 相对分子质量的比较
        2.4 FT-IR谱图分析
        2.5 单糖组成的定量分析比较
        2.6 脱硫酸基分析
        2.7 甲基化分析
    3、本章小结
结论
参考文献
攻读博士学位期间取得的科研成果
    (Ⅰ) 攻读博士学位期间取得的学术成果
    (Ⅱ) 攻读博士学位期间参与的主要科研项目
致谢
作者简介
获奖情况



本文编号：3357485