宽体金线蛭/东亚钳蝎分离蛋白中抗凝血、抗疲劳活性肽的酶法制备及其结构鉴定研究

发布时间：2022-01-12 08:28

　　随着现在人们工作节奏加快,过度性疲劳的病症严重困扰着大量年轻人;由于现在人们的不良饮食结构和生活习惯,心脑血管等血栓性疾病在老年人当中的发病率也与日俱增。但目前市面上还尚未有安全可靠的可食性产品来帮助人们改善这两种多发病症。因此,本文对抗凝血和抗疲劳活性肽的深入研究探讨则显得非常有实用意义。宽体金线蛭、东亚钳蝎蛋白质含量高,是一种理想的制备活性多肽的原料。本文以宽体金线蛭、东亚钳蝎为原料,提取分离蛋白,通过酶法可控制备抗凝血、抗疲劳活性多肽,建立了最佳酶解工艺条件,并进行动物体内功效论证,再进行后续的分离纯化、多肽序列测定,分析探讨了氨基酸组成变化与多肽活性之间的关系,最后模拟多肽在体内胃肠道的消化吸收实验。采用碱溶酸沉法对宽体金线蛭、东亚钳蝎蛋白进行了较高得率的提取。HPLC分析表明,宽体金线蛭分离蛋白WPI的分子量分布主要集中在4230 Da到92362 Da,东亚钳蝎分离蛋白HPI的分子量分布主要集中在27510 Da到52436 Da范围。采用酶制剂Alcalase AF 2.4L,Trypsin,Papain,Pepsin,Protamex,Flavourzyme等,探讨了W... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 宽体金线蛭、东亚钳蝎抗凝血研究现状
        1.1.1 宽体金线蛭
        1.1.2 东亚钳蝎
    1.2 生物活性肽
        1.2.1 生物活性肽的研究进展
        1.2.2 生物活性肽的制备分离及鉴定
            1.2.2.1 活性肽制备方法
            1.2.2.2 国内外酶法制备活性肽现状
            1.2.2.3 生物活性肽的分离纯化
            1.2.2.4 生物活性肽的鉴定研究
    1.3 凝血及抗凝机制
    1.4 抗凝血活性肽的研究现状
    1.5 抗疲劳的研究
        1.5.1 抗疲劳的研究现状
        1.5.2 疲劳的产生机理
        1.5.3 抗疲劳肽机理
        1.5.4 活性肽体外抗氧化与体内抗疲劳之间的关联
    1.6 本课题研究的立题依据和主要研究内容
        1.6.1 本课题的立题依据
        1.6.2 主要研究内容
第二章 宽体金线蛭、东亚钳蝎分离蛋白的提取及理化性质
    2.1 引言
    2.2 实验材料与设备
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 主要仪器设备
        2.2.3 主要试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 基本成分的测定
        2.3.2 宽体金线蛭分离蛋白(WPI)和东亚钳蝎分离蛋白(HPI)的制备
        2.3.3 碱溶酸沉pH值确定
        2.3.4 分离蛋白提取率的计算
        2.3.5 分离蛋白的相对分子量分布
        2.3.6 分离蛋白的氨基酸组成分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 两种原料的主要成分
        2.4.2 碱溶酸沉过程中pH值的确定
        2.4.3 两种分离蛋白的相对分子量分布
        2.4.4 两种分离蛋白的氨基酸组成分析
    2.5 本章小结
第三章 宽体金线蛭、东亚钳蝎分离蛋白的酶解工艺研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料与设备
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 主要仪器设备
        3.2.3 主要试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 酶解工艺过程
        3.3.2 Alcalase催化分离蛋白水解工艺优化
        3.3.3 不同酶催化下分离蛋白转化为可溶性肽得率
            3.3.3.1 标准曲线绘制
            3.3.3.2 可溶性肽含量测定
        3.3.4 酶解分离蛋白产物的相对分子量测定
        3.3.5 氨基酸组成测定
        3.3.6 酶标仪测定抗凝血活性
            3.3.6.1 试剂配制
            3.3.6.2 抗凝血活性的测定
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 蛋白酶种类对两种分离蛋白WPI和HPI水解反应的影响
            3.4.1.1 加酶量对两种分离蛋白水解反应的影响
            3.4.1.2 底物浓度对两种分离蛋白水解反应的影响
            3.4.1.3 水解时间对两种分离蛋白水解反应的影响
    3.5 六种酶水解底物蛋白转化为可溶性肽的得率
    3.6 酶解产物WA和HA的相对分子量分布
    3.7 酶解产物的氨基酸组成
    3.8 本章小结
第四章 两种产物多肽的体内抗血栓活性评价
    4.1 引言
    4.2 实验材料与设备
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 主要仪器设备
        4.2.3 主要试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 小鼠分组饲养
        4.3.2 小鼠造模
        4.3.3 抗凝血四项基本指标 (APTT, PT, TT, FIB)
            4.3.3.1 APTT测定
            4.3.3.2 TT测定
            4.3.3.3 PT测定
            4.3.3.4 FIB测定
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 各组小鼠的黑尾出现率
        4.4.2 各组小鼠的黑尾比
        4.4.3 各剂量多肽对小鼠凝血功能的影响
    4.5 本章小结
第五章 两种产物多肽的抗氧化及抗疲劳活性评价
    5.1 引言
    5.2 实验材料与设备
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 主要仪器设备
        5.2.3 主要试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 产物多肽的抗氧化活性测定
            5.3.1.1 清除二苯代苦味酰基(DPPH·)能力的测定
            5.3.1.2 清除羟基自由基(·OH)能力的测定
            5.3.1.3 还原能力的测定
            5.3.1.4 对AAPH诱导红细胞氧化性溶血的抑制率测定
        5.3.2 小鼠体内抗疲劳实验
            5.3.2.1 小鼠分组饲养
            5.3.2.2 小鼠游泳训练
            5.3.2.3 小鼠力竭游泳实验
            5.3.2.4 小鼠体内各生化指标的测定
            5.3.2.5 数据的统计学处理
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 活性肽体外抗氧化指标评价
            5.4.1.1 两种酶解产物抑制自由基DPPH·的能力
            5.4.1.2 两种酶解产物抑制自由基·OH的能力
            5.4.1.3 两种酶解产物的还原能力
            5.4.1.4 两种酶解产物抑制AAPH诱导红细胞氧化性溶血的能力
        5.4.2 动物体内抗疲劳实验
            5.4.2.1 小鼠的体重变化
            5.4.2.2 灌胃物对小鼠力竭游泳时间的影响
            5.4.2.3 灌胃物对小鼠肝、肌糖原的影响
            5.4.2.4 灌胃物对小鼠体内血清乳酸(LD)形成的影响
            5.4.2.5 灌胃物对小鼠体内血清尿素氮(BUN)的影响
            5.4.2.6 灌胃物对小鼠体内血清肌酸激酶(CK)含量的影响
            5.4.2.7 灌胃物对小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响
    5.5 本章小结
第六章 抗凝血多肽的分离纯化及结构鉴定
    6.1 引言
    6.2 实验材料与设备
        6.2.1 实验材料
        6.2.2 主要仪器设备
        6.2.3 主要试剂
    6.3 实验方法
        6.3.1 DEAE sepharose FF阴离子交换柱的分离纯化
        6.3.2 水解物的疏水值计算
        6.3.3 凝胶Sephadex G-15 层析分离
        6.3.4 制备型RP-HPLC柱分离活性肽
        6.3.5 溶血栓活性实验
        6.3.6 分离纯化肽的氨基酸组成及疏水值测定
        6.3.7 多肽的MALDI-TOF-TOF MS序列测定
        6.3.8 模拟胃肠道消化实验
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 酶解产物HA的分离纯化
        6.4.2 酶解产物WA的分离纯化
        6.4.3 组分WA_(3-1)的体外溶栓活性
        6.4.4 分离过程中各产物的氨基酸组成比较
        6.4.5 分离纯化多肽组分WA_(3-1)和HA_(183B-8)的结构鉴定
        6.4.6 模拟胃肠道消化对WA_(3-1), HA_(183B-8)的生物活性的影响
    6.5 本章小结
第七章 合成活性肽的体外模拟小肠吸收研究
    7.1 引言
    7.2 实验材料与设备
        7.2.1 实验材料
        7.2.2 主要仪器设备
        7.2.3 主要试剂
    7.3 实验方法
        7.3.1 合成肽的纯化及鉴定
        7.3.2 Caco-2 细胞模型的建立
        7.3.3 合成肽在Caco-2 细胞模型中的吸收实验
    7.4 结果与讨论
        7.4.1 两种合成肽的纯化及鉴定
        7.4.2 合成肽在Caco-2 细胞模型中的转运
    7.5 本章小结
结论与展望
    一 结论
    二 主要创新点
    三 展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：3584457