甘蔗多酚分离鉴定及生物活性研究

发布时间：2017-05-13 15:27

  本文关键词：甘蔗多酚分离鉴定及生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甘蔗含有大量的多酚和黄酮类色素物质,这些物质具有较强的清除自由基能力和抗氧化活性,对人类的营养、健康和疾病防治具有重要意义。我国甘蔗资源丰富,年产量超过1亿吨,加工过程中会产生大量的蔗渣,约占甘蔗重量的25%,除含大量纤维素、戊糖外,还富含多酚类物质。一直以来蔗渣的高值化利用率低。目前有关甘蔗多酚的研究主要集中在分离提取方面,而对甘蔗多酚结构鉴定和生理活性研究与多酚中抗氧化活性物质快速检测方法研究较少。为提升我国甘蔗制糖行业的综合利用度,并为深入系统地研究和开发甘蔗多酚提供可借鉴的技术和理论依据,本文研究了运用超声波辅助溶剂提取甘蔗渣中多酚类化合物的最佳工艺技术,并采用HPLC-ESI-MS鉴定其结构,建立了HPLC柱后衍生简便快速筛选抗氧化活性成分的方法,对甘蔗酚类物质的抑菌特性及抗癌活性及机理进行了研究。主要工作如下:(1)以甘蔗渣为原料,研究了超声波乙醇辅助提取甘蔗多酚的最佳工艺条件,对影响甘蔗多酚含量的关键因子及其相互作用进行了探讨。实验结果表明:最佳提取条件为:乙醇浓度为50.0%、料液比为1:15、提取温度为60℃和超声时间为30 min,在此条件下得到甘蔗多酚实际提取率为2.853mg/g蔗渣。(2)利用HPLC-ESI-MS联用技术,对甘蔗多酚提取物分离检测,分离出11种酚类化合物,确定了汉黄芩苷、二苯乙烯苷、绿原酸等9种化合物成分,其中二苯乙烯苷、汉黄芩苷两种物质为首次报道从甘蔗中鉴定出的化合物。(3)建立了甘蔗多酚提取物抗氧化活性成分快速在线筛选方法。通过优化在线系统参数,从甘蔗提取物中共筛选出7种具有抗氧化活性的化合物,确定其中四种分别为二苯乙烯苷、迷迭香酸、绿原酸、4,5-O-二咖啡酰奎尼酸,属于有开发潜力的抗氧化剂。(4)用DPPH抗氧化体系评价二苯乙烯苷、迷迭香酸、绿原酸、4,5-O-二咖啡酰奎尼酸四种多酚单体的抗氧化能力,并将其用不同浓度进行组合分析抗氧化协同增效作用。结果表明,DPPH体系中,四种甘蔗多酚单体的抗氧化活性顺序为:迷迭香酸4,5-O-二咖啡酰奎尼酸绿原酸二苯乙烯苷。通过分析不同浓度四种多酚单体抗氧化协同效应,发现迷迭香酸不仅本身具有很好的抗氧化活性,在20-60μg/m L范围内与其他多酚单体组合大多具有较好的协同增效作用。(5)研究发现甘蔗多酚提取物具有较显著的抑菌功能,采用二倍稀释法测得样品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌具有较强的抑菌能力,最小抑菌浓度分别为2.5mg/m L、0.625mg/m L、1.25mg/m L和2.5mg/m L。表明多酚提取物具有广谱抑菌效果,样品对革兰氏阳性菌的抑制能力优于革兰氏阴性菌。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,甘蔗多酚提取物能够抑制金黄色葡萄球菌细胞蛋白合成,尤其对菌体蛋白作用明显,多酚作用12小时后,添加组总蛋白含量仅为对照组的2.3%。通过扫描电镜、透射电镜观察,经甘蔗多酚提取物作用大肠杆菌及金黄色葡萄球菌后菌体表面和内部结构均发生改变,细胞壁被破坏,破坏其结构原有的完整性,进而导致细胞内容物泄漏,从而干扰菌体正常的生理代谢过程,最终对菌体生长起到抑制作用。(6)通过倒置显微镜观察CACO-2结肠癌细胞和Hep G2肝癌细胞的形态,结果表明:与对照组相比经多酚提取物处理的癌细胞均受到较强的抑制,甘蔗多酚对两种肿瘤细胞都有较强的生长抑制作用。将不同浓度甘蔗多酚提取物处理CACO-2结肠癌细胞和Hep G2肝癌细胞,用MTT法测定增殖率,统计分析甘蔗多酚类化合物对癌细胞的抑制率,结果表明,甘蔗多酚提取物对两种肿瘤细胞生长的抑制作用呈现较好的剂量-时间-效应关系,甘蔗多酚提取物对肝癌处理组的抑制效果高于结肠癌细胞。流式细胞检测结果进一步说明了甘蔗多酚提取物能够诱导CACO-2结肠癌细胞和Hep G2肝癌细胞发生凋亡,在一定浓度范围内与多酚的抗肿瘤效果呈剂量关系。研究了甘蔗多酚对Hep G2细胞周期的影响及其可能机制。将浓度300μg/m L、600μg/m L、1200μg/m L甘蔗多酚处理Hep G2细胞,采用流式细胞术检测细胞周期,Westem blot检测Cyclin D1、P21蛋白表达变化。结果表明空白组的Gl期细胞比例占24.84%,而低、中、高剂量加药组G1期细胞比例分别为26.60%、47.55%、55.23%,相对于未加组,G1期细胞显著增多。P21蛋白表达量分别为对照组的1.17、1.32、1.53倍,Cyclin D1蛋白表达量分别为对照组的0.83、0.78、0.76倍。表明甘蔗多酚可能同时通过上调P21蛋白水平的表达及抑制Cyclin Dl蛋白水平的表达来抑制肝癌细胞Hep G2的增值。Westem blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达变化,发现经甘蔗多酚处理肝癌细胞株Hep G2可以上调促凋亡蛋白Bax的表达,同时使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,表明甘蔗多酚可以通过调控凋亡蛋白的表达达到诱导癌细胞凋亡的目的。
【关键词】：甘蔗多酚 抗氧化 在线筛选 生物活性 抑制
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ914.1
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 绪论13-35
• 1.1 引言13-14
• 1.2 植物多酚的研究概述14-23
• 1.2.1 植物多酚的主要分类及结构特点14-15
• 1.2.2 植物酚类化合物的主要提取方法15-16
• 1.2.3 植物酚类化合物的分离纯化方法16-18
• 1.2.4 多酚类物质的结构鉴定18-19
• 1.2.5 植物多酚类物质的生物活性19-22
• 1.2.6 植物多酚抗氧化活性研究方法22
• 1.2.7 应用在线HPLC技术对天然抗氧化成份筛选22-23
• 1.3 甘蔗中抗氧化物质研究现状23-24
• 1.4 立题背景与主要研究内容24-25
• 1.4.1 立题背景与研究意义24-25
• 1.4.2 主要研究内容25
• 参考文献25-35
• 第二章 甘蔗渣多酚的提取及结构鉴定35-58
• 2.1 前言35
• 2.2 材料与方法35-39
• 2.2.1 实验材料35-36
• 2.2.2 主要试剂36
• 2.2.3 主要仪器与设备36-37
• 2.2.4 实验方法37-39
• 2.3 结果与讨论39-54
• 2.3.1 超声波辅助提取甘蔗中多酚类化合物的工艺研究39-46
• 2.3.2 HPLC分离方法流动相的确定46-47
• 2.3.3 HPLC-MS对甘蔗多酚提取物的研究结果47-54
• 2.4 本章小结54-55
• 参考文献55-58
• 第三章 基于在线HPLC技术对甘蔗多酚抗氧化活性成分的在线筛选58-69
• 3.1 前言58-59
• 3.2 材料与方法59-61
• 3.2.1 实验仪器与试剂59
• 3.2.2 实验方法59-61
• 3.3 结果与讨论61-65
• 3.3.1 在线筛选系统参数优化61-62
• 3.3.2 重现性试验结果62
• 3.3.3 基于在线HPLC技术对甘蔗多酚抗氧化活性成分的筛选结果62-65
• 3.4 本章小结65
• 参考文献65-69
• 第四章 甘蔗多酚抗氧化活性评价及协同作用研究69-81
• 4.1 前言69
• 4.2 材料与方法69-71
• 4.2.1 实验仪器与试剂69-70
• 4.2.2 实验方法70-71
• 4.3 结果与讨论71-78
• 4.3.1 DPPH体系中不同浓度主要抗氧化成分抗氧化活性的评价71-73
• 4.3.2 DPPH体系中4种甘蔗多酚单体的抗氧化协同效应73-76
• 4.3.3 抗氧化反应过程中多酚结构变化分析76-78
• 4.4 本章小结78-79
• 参考文献79-81
• 第五章 甘蔗多酚提取物抑菌性研究81-97
• 5.1 前言81
• 5.2 材料与方法81-84
• 5.2.1 实验材料81-82
• 5.2.2 主要试剂82
• 5.2.3 主要仪器与设备82
• 5.2.4 实验方法82-84
• 5.3 结果与讨论84-93
• 5.3.1 牛津杯法抑菌实验测定结果84-85
• 5.3.2 甘蔗多酚提取物对不同菌细胞膜通透性的影响研究85-86
• 5.3.3 细菌蛋白质SDS -PAGE电泳分析86-87
• 5.3.4 甘蔗多酚提取物对菌体外观结构的影响87-91
• 5.3.5 甘蔗多酚提取物对菌体外观结构的影响91-93
• 5.4 本章小结93-94
• 参考文献94-97
• 第六章 甘蔗多酚对癌细胞增殖和凋亡的影响97-116
• 6.1 前言97
• 6.2 材料与方法97-102
• 6.2.1 实验材料与试剂97-98
• 6.2.2 主要仪器与设备98
• 6.2.3 实验方法98-102
• 6.3 结果与讨论102-112
• 6.3.1 甘蔗多酚提取物对癌细胞增值的影响102-106
• 6.3.2 流式检测和分析多酚对癌细胞凋亡的影响106-109
• 6.3.3 甘蔗多酚提取物对人体肝癌Hep G2细胞周期分布的影响109-110
• 6.3.4 Westem blot测定细胞周期蛋白表达的影响110-111
• 6.3.5 Westem Blot检测细胞凋亡蛋白表达的影响111-112
• 6.4 本章小结112-113
• 参考文献113-116
• 结论与展望116-120
• （一）结论116-118
• （二）创新点118
• （三）展望118-120
• 攻读博士学位期间取得的研究成果120-121
• 致谢121-122
• 附件122

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 区惠敏;郭娟;龚玉石;叶金连;杨师涵;区卓颖;;甘蔗渣多酚的纯化及抗氧化活性研究[J];现代食品科技;2013年07期

2 唐艳;张宾;霍健聪;邓尚贵;;12种中草药抑菌作用研究[J];浙江海洋学院学报(自然科学版);2012年02期

3 何扩;李玉锋;张秀媛;赵瑾;;超临界流体萃取银杏叶黄酮类物质的研究[J];山西食品工业;2005年04期

4 吴国宏;熊何健;;荔枝叶中多酚类物质的提取制备[J];食品科学;2007年06期

5 张泽生;徐英;;大孔吸附树脂对苹果渣中苹果多酚吸附性能的研究[J];食品研究与开发;2006年09期

6 董璐;代增英;韩晴;冯建岭;李迎秋;;茶多酚的抑菌作用研究进展[J];山东食品发酵;2014年03期

7 姜艳艳,刘斌,石任兵;高效液相色谱—质谱联用技术在天然产物分离鉴定中的应用[J];药品评价;2005年01期

8 刘婷;丁忱欢;李鹤;;3种中草药提取物对疮疡致病菌的体外抑菌活性研究[J];中南药学;2014年12期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 吴兰兰;龙眼核多酚的分离纯化及其结构和抗氧化活性研究[D];集美大学;2010年

  本文关键词：甘蔗多酚分离鉴定及生物活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：362945