细菌来源的α-葡糖苷酶HaG的三维立体结构解析及催化反应机理分析

发布时间：2017-06-15 14:04

  本文关键词：细菌来源的α-葡糖苷酶HaG的三维立体结构解析及催化反应机理分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：α-葡糖苷酶是一种广泛存在于生物体中、参与初级代谢反应的最重要的酶之一。它与多种疾病如糖尿病、癌症等相关,并且在工业生产和医药领域都有广泛的应用。本研究以来源于海洋嗜盐菌的α-葡糖苷酶Ha G为研究对象,以单晶X射线衍射为主要研究手段,通过解析其三维立体结构,结合生化学实验,从原子水平上阐明了其外在特殊性质的内在分子机制,建立了结构与功能之间的关系,为α-葡糖苷酶的改造和应用奠定基础。主要研究内容与结果如下:一、野生型Ha G的异源表达、纯化,晶体制备和结构解析将Ha G的基因克隆至表达载体p FLAG-CTS中,于大肠杆菌中进行过量表达。采用渗透休克法提取目的蛋白,并依次选用弱阴离子交换柱层析和分子排阻色谱等方法得到了高纯度、有活性的Ha G蛋白质样品。采用坐滴法进行蛋白质结晶,经过筛选和优化,成功地获得了可供衍射用的高质量蛋白质单晶。在日本同步辐射中心采集晶体衍射数据,通过分子置换法解析了Ha G的三维立体结构。Ha G在立体结构上分为主要负责催化的N末端结构域、维持构型稳定的C末端结构域以及一个亚结构域,其活性中心口袋由15个氨基酸残基构成,位于N末端结构域的(α/β)8桶状结构中间。二、Ha G及其突变体与配基复合体的晶体结构解析通过定点突变获得了没有催化活性的突变体E271Q、D202N和D333N,以共结晶或浸泡的方法筛选得到4种复合体晶体:(1)Glucosyl-Ha G,为野生型Ha G催化反应的中间体,体现了α-葡糖苷酶催化反应的真实过程;(2)E271Q-Mal,为GH13家族中首个α-(1,4)糖苷键类型的底物复合体结构,此结构中存在114个残基电子云密度缺失,推测此部分在反应发生时会移动,使底物顺利进入活性中心口袋;(3)D202N-Glu-Gly,模拟了以甘油为接受底物时的糖基转移反应,阐明了Ha G催化甘油生成甘油葡萄糖苷的反应特点;(4)D333N-Rb,利用重金属Rb+在特殊波长X射线下的异常信号确定了Rb+在晶体结构中的位置。三、Ha G底物特异性和催化反应机理的结构学基础通过将Ha G复合体结构与其他酶对比分析,并结合突变实验和酶学实验,阐明了Ha G底物特异性:(1)Ha G特有的超长(β→α)4无规则卷曲阻挡于活性中心入口处,决定了其对于短链底物的特异性;(2)底物糖苷键特异性是由两个残基Thr203和Phe297所决定的,同时,残基Gly228对糖苷键的识别也有辅助作用。并且,将所有的复合体结构联系起来,阐明了反应机理的分子机制,为经典的双替代理论提供了结构学基础。
【关键词】：α-葡糖苷酶 蛋白质结晶 三维立体结构 底物特异性 催化机理
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 绪论14-30
• 1.1 α-葡糖苷酶的研究现状14-17
• 1.1.1 α-葡糖苷酶的定义与来源14
• 1.1.2 α-葡糖苷酶的分类14-15
• 1.1.3 α-葡糖苷酶的催化原理15-17
• 1.2 α-葡糖苷酶在生产中的重要应用17-18
• 1.2.1 工业生产低聚异麦芽糖17
• 1.2.2 嗜热 α-葡糖苷酶在酒精生产中的应用17
• 1.2.3 催化合成糖基化产物17-18
• 1.2.4 α-葡糖苷酶抑制剂治疗糖尿病18
• 1.3 α-葡糖苷酶HaG的研究背景18-21
• 1.4 研究生物大分子的最重要方法——蛋白质单晶X射线衍射21-26
• 1.4.1 结构生物学的研究方法21-23
• 1.4.2 单晶XRD解析蛋白质立体结构23-26
• 1.4.3 蛋白质结晶学的重要意义26
• 1.5 本论文的研究背景和研究内容26-30
• 1.5.1 研究背景26-29
• 1.5.2 主要研究内容29
• 1.5.3 研究意义29-30
• 第二章 α-葡糖苷酶 HaG 的体外表达及其分离纯化30-47
• 2.1 引言30-31
• 2.2 实验仪器及材料31-32
• 2.2.1 仪器设备31
• 2.2.2 主要实验材料与试剂31-32
• 2.3 实验方法32-38
• 2.3.1 HaG的异源表达载体的构建32-33
• 2.3.2 HaG重组蛋白的诱导表达与大量制备33-35
• 2.3.3 渗透休克法提取周质蛋白35-36
• 2.3.4 阴离子交换柱层析分离重组蛋白36-37
• 2.3.5 分子排阻色谱纯化重组蛋白37-38
• 2.3.6 高纯度重组蛋白的透析38
• 2.4 结果与讨论38-46
• 2.4.1 HaG的蛋白质序列分析38-40
• 2.4.2 HaG重组蛋白诱导表达检验40-42
• 2.4.3 HaG重组蛋白的分离纯化42-46
• 2.5 本章小结46-47
• 第三章 葡糖苷酶HaG的蛋白质单晶制备研究47-56
• 3.1 引言47
• 3.2 实验仪器及材料47-48
• 3.2.1 仪器设备47-48
• 3.2.2 主要实验材料与试剂48
• 3.3 实验方法48-50
• 3.3.1 结晶前蛋白质样品的准备48-49
• 3.3.2 HaG蛋白质结晶条件初筛49
• 3.3.3 In-house X射线衍射初步鉴定49-50
• 3.3.4 HaG蛋白质结晶条件的优化与高质量晶体的制备50
• 3.4 结果与讨论50-55
• 3.4.1 结晶初筛结果50-52
• 3.4.2 X射线衍射初步鉴定52-54
• 3.4.3 HaG蛋白质结晶条件的优化结果与单晶鉴定54-55
• 3.5 本章小结55-56
• 第四章 野生型 HaG 晶体的衍射数据采集和结构解析56-75
• 4.1 引言56-57
• 4.2 实验仪器及材料57-58
• 4.2.1 仪器设备57
• 4.2.2 主要实验材料与试剂57-58
• 4.3 实验方法58-63
• 4.3.1 蛋白晶体的冻结58-59
• 4.3.2 HaG蛋白晶体X射线衍射的数据采集59-60
• 4.3.3 HaG蛋白质晶体数据处理60-61
• 4.3.4 分子置换法确定HaG蛋白质结构的相位61-62
• 4.3.5 HaG蛋白质结构的优化62
• 4.3.6 HaG蛋白质结构的分析与图片绘制62-63
• 4.4 结果与讨论63-74
• 4.4.1 HaG蛋白质晶体的数据采集63-64
• 4.4.2 HaG蛋白分子结构解析过程64-68
• 4.4.3 野生型HaG蛋白质的立体结构分析68-74
• 4.5 本章小结74-75
• 第五章 α-葡糖苷酶突变体建构、表达及其复合体晶体制备与结构解析75-96
• 5.1 引言75-76
• 5.2 实验仪器及材料76-77
• 5.2.1 仪器设备76
• 5.2.2 主要实验材料与试剂76-77
• 5.3 实验方法77-81
• 5.3.1 活性缺失突变体的制备77-78
• 5.3.2 复合体晶体筛选与制备78-79
• 5.3.3 HaG及其突变体的复合体晶体的数据采集及处理79-80
• 5.3.4 HaG及其突变体的复合体结构解析80-81
• 5.3.5 圆二色谱测定突变体二级结构的无序程度81
• 5.4 结果与讨论81-94
• 5.4.1 复合体晶体的制备81-82
• 5.4.2 复合体晶体的结构解析82-85
• 5.4.3 复合体立体结构分析85-94
• 5.5 本章小结94-96
• 第六章 HaG 的底物特异性和催化机理的分子机制96-112
• 6.1 引言96
• 6.2 实验仪器及材料96-97
• 6.2.1 仪器设备96
• 6.2.2 主要实验材料与试剂96-97
• 6.3 实验方法97-100
• 6.3.1 HaG片段缺失突变体的制备97-98
• 6.3.2 HaG片段缺失突变体（HaG-LD）的酶活测定98-99
• 6.3.3 HaG复合体与其他糖苷水解酶的结构对比99-100
• 6.4 结果与讨论100-110
• 6.4.1 HaG片段缺失突变体的制备过程100-102
• 6.4.2 HaG片段缺失突变体的酶学性质分析102-104
• 6.4.3 HaG底物特异性的结构学分析104-108
• 6.4.4 α-葡糖苷酶HaG催化反应机理分析108-110
• 6.5 本章小结110-112
• 结论与展望112-116
• 参考文献116-126
• 攻读博士学位期间取得的研究成果126-127
• 致谢127-128
• 附件128

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 黄祥斌,于淑娟;低聚异麦芽糖的最新研究进展[J];中国甜菜糖业;2003年03期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 刘军;嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）α-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及酶学性质分析[D];北京化工大学;2006年

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本文编号：452600