基于均一PLA微球的新型乙肝疫苗佐剂设计制备及其免疫增强效果研究

发布时间：2017-06-30 22:16

  本文关键词：基于均一PLA微球的新型乙肝疫苗佐剂设计制备及其免疫增强效果研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙型肝炎是乙肝病毒(HBV)感染引起的传染性疾病,感染的慢性化往往导致肝硬化和肝癌,严重威胁人类的健康。目前尚没有治愈乙肝的有效药物,接种疫苗仍然是预防HBV感染的有效方法。基因重组的乙肝疫苗的安全性得到改善,但其免疫原性和稳定性降低,需要添加佐剂才能诱导有效的免疫应答。铝盐佐剂是目前人用疫苗的主要佐剂,虽然其能够增强抗原诱导的抗体反应,但提升疫苗的细胞免疫应答能力有限,而细胞免疫是机体发挥抗HBV等胞内感染病毒的关键,因此新一代的乙肝疫苗及治疗性乙肝疫苗亟需开发能够提升细胞免疫的新型佐剂系统。纳微球颗粒佐剂因其大小和易于激活免疫系统的各类病原体的直径类似,具有良好的研究与应用前景。其中,可降解聚合物-聚乳酸(PLA)类纳微球是最有前景的颗粒佐剂之一,纳微球能够促进抗原被提呈细胞摄取并经MHCI途径提呈,诱导更高水平的细胞和体液免疫应答。传统微球佐剂疫苗研究一般采用包埋的方式携载抗原,由于包埋的过程往往涉及油水界面、超声、机械搅拌等剧烈条件,易造成抗原的失活变性；这些方法所制备的纳微球粒径不均一,分布范围宽,最终影响体内药效发挥；另外影响包埋效率和抗原活性的因素众多,都极大地限制了其放大生产。新型佐剂的设计需要兼顾易于生产制备和良好的免疫效果。本论文围绕PLA微球在新型乙肝疫苗中的可应用性展开,在前期研究的基础上,采用实验室开发的新型膜乳化技术制备粒径均一的纳微球颗粒,采用微球表面吸附的温和方式携载抗原。第二章证实抗原和均一的PLA微球复配混合能够诱导和铝佐剂相当的IgG抗体水平,同时增强相关细胞因子分泌和T细胞应答。分析发现,PLA微球本身对抗原的吸附率小于5%,为了提升微球的抗原吸附量,第三章设计制备了PLA微球表面磷酸钙修饰的CaP-PLA微球,其抗原吸附率提升至50%以上。免疫结果证实,CaP-PLA微球吸附抗原能促进DC活化,进一步增强微球在体内诱导的细胞和体液免疫应答。CaP-PLA微球呈电中性,吸附抗原后呈负电性,影响抗原吸附,也不利于微球和抗原提呈细胞的相互作用。为了系统考察微球抗原吸附、电荷和免疫效果的关系,在第四章中,设计采用三种多聚阳离子聚合物壳聚糖(CS)、壳聚糖盐酸盐(CSC)和聚乙烯亚胺(PEI)对PLA微球表面进行镀层修饰,制备了表面具有不同正电荷的阳离子PLA微球。随着微球正电荷的递增,抗原吸附量随随之显著增加。随着微球电荷和抗原吸附量的增加,巨噬细胞的活化和抗原摄取-提呈随之增强。免疫小鼠后抗体和细胞免疫相关的细胞因子分泌也随微球抗原吸附量的增加而显著增强,其中Thl细胞免疫相关细胞因子IFN-γ和IL-12的水平尤其显著。表明通过阳离子修饰增加PLA微球表面的正电荷,增强PLA微球的抗原吸附能够显著增强微球疫苗的免疫应答,尤其是细胞免疫。为了优选适合阳离子改性PLA微球的免疫途径,在第五章中,考察了皮下、肌肉和腹腔注射对疫苗免疫应答的种类和强度的影响,证实肌肉注射是适合PLA微球的有效接种途径,它能够诱导比铝佐剂疫苗更高的保护性免疫应答,尤其是细胞免疫。综合上述影响PLA微球佐剂效果的因素,第六章采用一步法设计制备了安全性更高的阳离子脂-PLA复合的DDAB-PLA微球：DDAB-PLA微球电荷在+30mV左右,抗原吸附率大于75%。肌肉免疫证实,DDAB-PLA微球吸附抗原能够诱导比铝佐剂更高水平的IgG抗体(1.3倍)和显著增强的细胞免疫相关细胞因子分泌以及效应性T细胞应答,显示出更出色的佐剂效果。DDAB-PLA微球易于制备和放大,免疫效果良好,有望用于开发新型乙肝疫苗和治疗性乙肝疫苗。
【关键词】：PLA 微球 佐剂 乙肝表面抗原 吸附 细胞免疫
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.6
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 1 文献综述15-49
• 1.1 免疫系统与免疫应答概述15-22
• 1.1.1 免疫系统组成15
• 1.1.2 抗原15-16
• 1.1.3 佐剂16
• 1.1.4 抗原提呈16-17
• 1.1.5 免疫预防17-18
• 1.1.6 免疫应答18-22
• 1.1.6.1 固有免疫18-20
• 1.1.6.2 固有免疫特点20-21
• 1.1.6.3 适应性免疫应答21-22
• 1.1.6.4 适应性免疫应答的特点22
• 1.2 乙肝病毒与乙肝疫苗22-27
• 1.2.1 HBV22-24
• 1.2.2 HBV与免疫应答24-26
• 1.2.2.1 HBV和固有免疫24-25
• 1.2.2.3 HBV和适应性免疫应答25-26
• 1.2.3 慢性乙肝与免疫耐受26-27
• 1.3 乙肝疫苗与乙肝表面抗原27-32
• 1.3.1 乙肝表面抗原27-29
• 1.3.2 乙肝疫苗的发展29-30
• 1.3.3 乙肝疫苗存在的问题30
• 1.3.4 治疗性乙肝疫苗30-32
• 1.4 聚合物纳微球疫苗佐剂32-37
• 1.4.1 聚合物纳微球的制备33-36
• 1.4.1.1 溶剂挥发法33-34
• 1.4.1.2 化学交联法34-35
• 1.4.1.3 自组装法35-36
• 1.4.2 快速膜乳化技术36-37
• 1.5 纳微球疫苗佐剂研究进展37-40
• 1.5.1 微包埋抗原微球疫苗37-39
• 1.5.2 表面吸附抗原微球疫苗39-40
• 1.6 纳微球佐剂的优势40-45
• 1.6.1 纳微球佐剂的抗原APC靶向40-41
• 1.6.2 纳微球佐剂增强抗原交叉提呈41-44
• 1.6.3 纳微球载体的免疫激活作用44-45
• 1.7 聚合物纳微球用于疫苗佐剂的优势和挑战45-46
• 1.8 立题依据和研究目标46-49
• 1.8.1 立题依据46-47
• 1.8.2 研究目标及方法47-49
• 2 均一PLA微球用于乙肝疫苗的可行性考察49-65
• 2.1 引言49-50
• 2.2 实验材料和方法50-58
• 2.2.1 实验试剂50-51
• 2.2.2 实验设备和仪器51-52
• 2.2.3 试验方法52-58
• 2.2.3.1 PLA微球制备52
• 2.2.3.2 微球表征52-53
• 2.2.3.3 佐剂-抗原剂型配伍53
• 2.2.3.4 小鼠及免疫方案53-54
• 2.2.3.5 免疫结果测定54-57
• 2.2.3.6 统计学分析57-58
• 2.3 实验结果和讨论58-64
• 2.3.1 PLA微球制备和表征58-59
• 2.3.2 体液免疫应答59-62
• 2.3.3 细胞因子测定62-63
• 2.3.4 ELISPOT分析63-64
• 2.4 本章小结64-65
• 3 CaP-PLA微球制备及其佐剂效果考察65-93
• 3.1 引言65-66
• 3.2 实验材料和方法66-77
• 3.2.1 实验试剂66-67
• 3.2.2 实验设备和仪器67-68
• 3.2.3 试验方法68-77
• 3.2.3.1 CaP-PLA微球制备68-69
• 3.2.3.2 PLA微球制备69-70
• 3.2.3.3 微球表征70
• 3.2.3.4 HBsAg吸附70-71
• 3.2.3.5 CaP-PLA微球表面酸敏特性考察71
• 3.2.3.6 小鼠髓源DC(BMDC)提取及体外活化考察71-72
• 3.2.3.7 小鼠及免疫方案72-74
• 3.2.3.8 免疫结果测定74-77
• 3.2.3.9 统计学分析77
• 3.3 实验结果和讨论77-92
• 3.3.1 PLA和CaP-PLA微球制备与表征77-79
• 3.3.2 CaP-PLA微球的酸敏特性79-82
• 3.3.3 体外DC活化82-83
• 3.3.4 血清中IgG,IgG1,IgG2a及IgM效价83-87
• 3.3.5 脾细胞体外增殖87-89
• 3.3.6 细胞因子测定89-92
• 3.4 本章小结92-93
• 4 阳离子修饰PLA微球制备及其对PLA佐剂性能的调节93-121
• 4.1 引言93-94
• 4.2 实验材料和方法94-105
• 4.2.1 实验试剂94-95
• 4.2.2 实验设备和仪器95-96
• 4.2.3 试验方法96-105
• 4.2.3.1 PLA微球制备96
• 4.2.3.2 PLA微球的镀层修饰96-97
• 4.2.3.3 微球表征97
• 4.2.3.4 HBsAg吸附97-98
• 4.2.3.5 小鼠腹腔巨噬细胞的分离及培养98-99
• 4.2.3.6 CCK-8法测定微球的细胞毒性99-100
• 4.2.3.7 巨噬细胞抗原摄取分析100-101
• 4.2.3.8 小鼠及免疫方案101-102
• 4.2.3.9 免疫结果测定102-105
• 4.2.3.10 统计学分析105
• 4.3 实验结果和讨论105-120
• 4.3.1 微球制备和表征105-107
• 4.3.2 微球吸附乙肝表面抗原107-108
• 4.3.3 体外抗原摄取108-110
• 4.3.4 抗原胞内定位110-111
• 4.3.5 微球的细胞毒性111-112
• 4.3.6 巨噬细胞活化112-114
• 4.3.7 IgM和IgG抗体效价114-116
• 4.3.8 细胞因子测定116-118
• 4.3.9 ELISPOT分析118-120
• 4.4 本章小结120-121
• 5 免疫途径对微球佐剂疫苗的应答调节121-145
• 5.1 引言121-122
• 5.2 实验材料和方法122-132
• 5.2.1 实验试剂122-123
• 5.2.2 实验设备和仪器123-124
• 5.2.3 试验方法124-132
• 5.2.3.1 CSC-PLA微球制备124
• 5.2.3.2 PLA微球的镀层修饰124-125
• 5.2.3.3 微球表征125
• 5.2.3.4 HBsAg吸附125-126
• 5.2.3.5 小鼠髓源DC(BMDC)提取及体外活化考察126-127
• 5.2.3.6 小鼠及免疫方案127-129
• 5.2.3.7 免疫结果测定129-132
• 5.2.3.8 统计学分析132
• 5.3 实验结果和讨论132-142
• 5.3.1 CSC-PLA微球制备与表征132-133
• 5.3.2 体外佐剂效果评价133-134
• 5.3.3 体液免疫应答分析134-137
• 5.3.4 脾细胞活化137-139
• 5.3.5 细胞因子测定139-142
• 5.4 本章小结142-145
• 6 DDAB-PLA微球制备及其佐剂效果考察145-171
• 6.1 引言145-146
• 6.2 实验材料和方法146-157
• 6.2.1 实验试剂146-147
• 6.2.2 实验设备和仪器147-148
• 6.2.3 试验方法148-157
• 6.2.3.1 DDAB-PLA微球制备148-149
• 6.2.3.2 PLA微球制备149
• 6.2.3.3 微球表征149-150
• 6.2.3.4 HBsAg吸附150
• 6.2.3.5 小鼠髓源DC(BMDC)提取及体外活化考察150-152
• 6.2.3.6 小鼠及免疫方案152-153
• 6.2.3.7 免疫结果测定153-157
• 6.2.3.8 统计学分析157
• 6.3 实验结果和讨论157-169
• 6.3.1 DDAB-PLA微球制备和表征157-160
• 6.3.2 微球的细胞毒性160
• 6.3.3 体外DC活化160-162
• 6.3.4 血清中IgM,IgG,IgG1及IgG2a效价162-164
• 6.3.5 脾细胞增殖164-165
• 6.3.6 细胞因子测定165-169
• 6.3.7 CTL活化169
• 6.4 本章小结169-171
• 7 结论与展望171-177
• 7.1 引言171-172
• 7.2 本论文的主要结论172-173
• 7.3 本研究的创新点173-175
• 7.4 工作展望175-177
• 7.4.1 DDAB-PLA微球佐剂乙肝疫苗剂型优化175
• 7.4.2 DDAB-PLA微球在其他抗原疫苗中的应用及其免疫增强机制175
• 7.4.3 DDAB-PLA微球中DDAB含量对微球免疫效果的调节175-176
• 7.4.4 联合TLR受体等免疫增强剂共用176
• 7.4.5 DDAB-PLA微球的系统毒性和代谢176-177
• 符号表177-179
• 参考文献179-191
• 个人简历及发表文章目录191-195
• 致谢195

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