桔青霉素单克隆抗体和单链抗体的筛选及鉴定研究

发布时间：2017-07-18 22:15

  本文关键词：桔青霉素单克隆抗体和单链抗体的筛选及鉴定研究

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【摘要】：桔青霉素(citrinin, CIT)是由青霉属和曲霉属等真菌产生的一种次级代谢产物,广泛存在于多种农产品和食品中。早年间,桔青霉素因为具有较好的抑菌效果,曾被作为抗生素进行使用,但后来经研究发现它也具有强烈的肾毒性和致癌性,严重危害人类和动物的健康。因此,建立一套针对桔青霉素残留的检测方法显得非常必要,而制备抗桔青霉素的特异性抗体对于临床检测方法的建立则具有重要的现实意义。本研究利用化学偶联方法分别制备了桔青霉素人工完全抗原CIT-BSA和CIT-OVA;采用细胞融合技术获得了抗桔青霉素的杂交瘤细胞株3B11及其单克隆抗体；根据基因工程原理构建了大容量、天然鼠源核糖体展示(Ribosome display, RD)单链抗体(Single-Chain Fragment Variant, scFv)文库；运用核糖体展示技术筛选到了抗桔青霉素的单链抗体基因。研究成果为桔青霉素的残留检测奠定了基础。1.桔青霉素完全抗原的合成与鉴定桔青霉素属于小分子半抗原,不具有免疫原性,无法直接用来对机体进行免疫制备抗体,所以,必须首先通过与蛋白载体进行偶联制成人工完全抗原。本研究采用碳二亚胺法,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀亚胺(NHS)作为偶联剂,牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)作为蛋白载体,分别制备了CIT-BSA和CIT-OVA人工完全抗原,并使用紫外光谱分析、SDS-PAGE以及MALDI-TOF质谱法分别对偶联反应前后物质进行鉴定。鉴定结果显示人工完全抗原CIT-BSA成功偶联,C1T与BSA的偶联比例约为5：1,可以用来对动物机体进行免疫制备相应的抗体。2.桔青霉素单克隆抗体的制备及鉴定为制备抗桔青霉素的单克隆抗体,本研究利用所制备的偶联抗原CIT-BSA对Balb/C小鼠进行免疫,取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,采用间接ELISA和竞争ELISA检测方法进行筛选,经3次亚克隆后筛选到5株稳定分泌抗桔青霉素抗体的杂交瘤细胞株,分别为2A9、3B5、3B11、3C5、 6C1.所筛选到的单克隆抗体经过初步鉴定,抗体亚类分别有IgM、IgG1、IgG2a;经间接竞争ELISA检测方法鉴定,单克隆抗体3B11对桔青霉素的IC50值为150.9 ng/mL,最低检测限ICl0为5.42 ng/mL;与展青霉毒素(PAT)、黄曲霉毒素(AFB1)、伏马毒素(FB1)和赭曲霉毒素(OTA)的交叉反应率均低于0.01%；抗体亲和力常数为7.75×107L/moL,属于高亲和力抗体。本实验所制备的单抗具有较好的抑制效果、灵敏性和特异性,为快速检测桔青霉素的酶联免疫检测方法的建立和检测试剂盒的研制提供了技术依据。3.大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库的构建与初步鉴定为构建大容量天然鼠源核糖体展示(Ribosome display, RD)单链抗体(Single-Chain Fragment Variant, scFv)基因文库,本研究通过提取SPF级小鼠脾脏总RNA,反转录为cDNA,分别利用引物扩增鼠抗体的VH、VL和C1c基因,采用重叠延伸PCR (SOE-PCR)方法,通过Linker ((Gly4Ser)3)相互拼接,构建了单链抗体scFv基因文库和核糖体展示基因文库：经连接转化,对所构建基因文库进行菌落PCR鉴定、序列测定和比对分析。所构建核糖体展示基因文库库容量约为5.6×1013,基因片段全长大小约为1100 bp,基因文库序列具有较好的完整性和多样性。本试验成功构建了一个大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库,为进一步筛选单链抗体奠定了基础。4.核糖体展示技术筛选抗桔青霉素的特异性单链抗体为获得桔青霉素特异性单链抗体,本研究在所构建的鼠源天然核糖体展示基因文库的基础上,采用核糖体展示技术进行体外转录和翻译,分别以人工完全抗原CIT-BSA、CIT-OVA和蛋白载体BSA、OVA为包被抗原,采用间接ELISA方法对其进行筛选,亲和筛选所获得的mRNA运用真核原位RT-PCR方法进行回收,所获得的cDNA利用表达载体pTIG-TRX在大肠杆菌内进行可溶性表达,并利用间接ELISA方法对表达产物进行鉴定。经过六轮亲和筛选和间接ELISA方法鉴定,共获得13个单链抗体基因,其中3个单链抗体(编号分别为23、68、109)与CIT具有较高的结合能力；间接竞争ELISA检测结果显示,68号单链抗体对CIT的IC5o值为1242.2 ng/mL,最低检测限LOD:ICio为3.1 ng/mL;并且与展青霉毒素(PAT)、黄曲霉毒素(AFB1)、伏马毒素(FB1)和赭曲霉毒素(OTA)的交叉反应率均低于0.01%；本实验运用核糖体展示技术获得抗CIT的单链抗体,对于建立CIT的快速检测方法具有重要的现实意义,同时也对与筛选其他小分子半抗原的特异性单链抗体以及建立新型检测技术奠定了基础。综上所述,本研究在人工完全抗原的基础上制备了抗桔青霉素的单克隆抗体与单链抗体,为建立桔青霉素残留检测方法奠定了基础,同时也为其他小分子半抗原单链抗体的制备提供了技术依据。
【关键词】：桔青霉素 单克隆抗体 核糖体展示 单链抗体
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS207.3
【目录】：

• 摘要10-13
• Abstract13-16
• 英文缩略词表16-17
• 前言17-18
• 第一部分 文献综述18-32
• 第一章 桔青霉素及其检测方法19-24
• 1 桔青霉素概述19-21
• 1.1 桔青霉素的理化性质19-20
• 1.2 桔青霉素的毒性和抑菌性20-21
• 1.3 桔青霉素的限量标准21
• 2 桔青霉素的检测方法21-23
• 2.1 薄层层析法22
• 2.2 高效液相色谱法22
• 2.3 酶联免疫吸附测定法22-23
• 3 小结23-24
• 第二章 抗体制备研究进展24-32
• 1 抗体制备概述24-25
• 1.1 多克隆抗体的制备24
• 1.2 单克隆抗体的制备24-25
• 1.3 基因工程重组抗体的制备25
• 2 抗体库技术25-31
• 2.1 噬菌体展示技术26-27
• 2.2 核糖体展示技术27-31
• 3 小结31-32
• 第二部分 研究内容32-105
• 第三章 桔青霉素完全抗原的合成与鉴定33-43
• 摘要33-34
• 1 材料和方法34-37
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 主要试剂34
• 1.1.2 主要仪器34-35
• 1.2 方法35-37
• 1.2.1 桔青霉素人工完全抗原的合成35-36
• 1.2.2 桔青霉素人工完全抗原的紫外光谱分析鉴定36
• 1.2.3 桔青霉素人工完全抗原的SDS-PAGE鉴定36-37
• 1.2.4 桔青霉素人工完全抗原的MALDI-TOF鉴定以及偶联比的测定37
• 2 结果37-39
• 2.1 桔青霉素及人工抗原的紫外光谱分析鉴定结果37-38
• 2.2 人工完全抗原的SDS-PAGE鉴定结果38-39
• 2.3 人工完全抗原的质谱鉴定结果39
• 3 讨论39-43
• 第四章 桔青霉素单克隆抗体的制备及鉴定43-75
• 摘要43-44
• 1 材料和方法44-57
• 1.1 材料44-45
• 1.1.1 主要试剂和耗材44
• 1.1.2 实验动物44
• 1.1.3 细胞系44-45
• 1.1.4 主要仪器45
• 1.1.5 主要试剂的配制45
• 1.2 方法45-57
• 1.2.1 Bradford法测蛋白质浓度45
• 1.2.2 动物免疫45-46
• 1.2.3 免疫小鼠血清效价测定46-48
• 1.2.4 单克隆抗体的制备与鉴定48-57
• 2 结果57-71
• 2.1 蛋白浓度的测定57-58
• 2.2 免疫小鼠血清效价的测定58-59
• 2.3 间接ELISA检测方法的建立59-62
• 2.4 间接竞争ELISA检测多抗血清的抑制性62
• 2.5 单克隆抗体细胞株的筛选与建立62-71
• 3 讨论71-75
• 第五章 大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库的构建与初步鉴定75-86
• 摘要75-76
• 1 材料和方法76-79
• 1.1 材料76
• 1.1.1 主要试剂76
• 1.1.2 主要仪器76
• 1.2 方法76-79
• 1.2.1 小鼠脾脏总RNA的提取76-77
• 1.2.2 cDNA的合成77
• 1.2.3 VH、Linker、VL和Cκ基因的扩增77
• 1.2.4 单链抗体scFv基因文库的组装和序列多样性分析77-79
• 1.2.5 核糖体展示基因文库的组装和序列分析79
• 2 结果79-83
• 2.1 VH、Linker、VL和Cκ基因的扩增与鉴定79-82
• 2.2 单链抗体scFv基因文库的扩增和序列多样性分析鉴定82
• 2.3 核糖体展示基因文库的扩增和序列分析鉴定82-83
• 3 讨论83-86
• 第六章 核糖体展示技术筛选抗桔青霉素的特异性单链抗体86-105
• 摘要86-87
• 1 材料和方法87-96
• 1.1 材料87-88
• 1.1.1 主要试剂87-88
• 1.1.2 主要仪器88
• 1.1.3 主要试剂的配制88
• 1.2 方法88-96
• 1.2.1 核糖体展示基因文库的体外转录翻译88-89
• 1.2.2 固相亲和筛选89-90
• 1.2.3 原位反转录回收90-91
• 1.2.4 PCR扩增及新一轮展示模板的构建91
• 1.2.5 筛选后单链抗体基因克隆的筛选91
• 1.2.6 单链抗体基因的原核表达与鉴定91-94
• 1.2.7 抗桔青霉素单链抗体的筛选与鉴定94-95
• 1.2.8 抗桔青霉素单链抗体基因序列比对分析95-96
• 2 结果96-101
• 2.1 体外转录翻译与亲和筛选96-97
• 2.2 单链抗体基因克隆的筛选97
• 2.3 单链抗体基因的原核表达与Western blot鉴定97-98
• 2.4 抗桔青霉素单链抗体结合活性的鉴定98-99
• 2.5 抗桔青霉素单链抗体竞争抑制效果与特异性的鉴定99-101
• 2.6 抗桔青霉素单链抗体基因序列的比对分析101
• 3 讨论101-105
• 结论105-106
• 创新点106-107
• 展望107-108
• 附录Ⅰ 溶液配制108-113
• 参考文献113-122
• 攻读博士学位期间的主要成果122-123
• 致谢123

【参考文献】

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本文编号：560043