大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究

发布时间：2017-08-20 14:19

  本文关键词：大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究

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【摘要】：脂肪醇广泛应用于化工、再生能源、医药等领域。近年来微生物发酵法生产脂肪醇的研究众多,已经初步实现了这类物质的可再生合成方法。然而,目前微生物发酵生产脂肪醇存在产量低、菌种改造缓慢、检测过程繁琐、代谢路径选择不合理等问题,严重制约了脂肪醇化合物的发酵法生产和工业化进程。本论文从化合物的理化性质、生理毒性、菌种改造手段、代谢路径优化等方面出发,提供了高效准确的基因组改造方法、简单快速的检测方法、构建了一系列脂肪醇高产的大肠杆菌工程菌,为实现大肠杆菌高产脂肪醇的“生物制造”奠定了基础。首先,本论文利用了大肠杆菌高频自发断裂和断裂后的同源重组修复机制,设计并实现了依靠正向重复序列辅助的大肠杆菌无痕编辑方法,命名为TRAGE.对可能影响TRAGE操作效率的因素(蔗糖加入节点、传代次数、传代时期)进行了系统考察,建立并优化了TRAGE操作流程,最终实现60小时内完成基因组的无痕编辑。其次,本论文利用正交试验优化了发酵液中脂肪醇和脂肪酸的提取方法,确定了提取条件,萃取剂是乙酸乙酯,溶剂和样品比例为1.2,摇床温度为10℃、转速260 rpm的条件下提取2 mmin。此外本论文建立了基于HPLC-RID的脂肪醇和脂肪酸的分析方法。利用C18色谱柱,流动相为甲醇：水：乙酸(90：9.9：0.1,v/v/v),流速为1.0 mL/min。验证试验显示标品线性良好(r2≥0.9989),日间和日内相对标准偏差分别小于4.46%和5.38%,证明该方法具有良好的重复性和准确度。再次,本论文提出了采用诱发脂肪酸饥饿促进脂肪醇积累的思路,并证明了其可行性。在利用TRAGE敲除大肠杆菌所有已知酯解酶基因的基础上,过量表达外源脂酰-ACP还原酶,使脂肪醇的积累量较改造前增加了1.4倍。在此基础上,本研究通过敲除副产物合成路径,降低有毒副产物产生,将脂肪醇的产量提高至6.33 g/L。此外,本论文首次利用RBS计算手段辅助设计脂肪醇合成路径上的相关基因的RBS位点,利用所开发TRAGE完成了对fabH、fabZ RBS区域的改造,最终结合发酵过程优化使得脂肪醇的产量达到9.35 g/L。
【关键词】：脂肪醇 基因组编辑 酯解酶 脂肪酸饥饿 合成生物学
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ923
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 1 文献综述15-31
• 1.1 引言15
• 1.2 基因组编辑方法15-19
• 1.2.1 依赖Cre/loxP和Flp/FRT基因组编辑15-17
• 1.2.2 通过“pop-in/pop-out”实现的基因组无痕编辑17
• 1.2.3 依赖识别特定序列的核酸酶的基因组编辑技术17-19
• 1.3 重组微生物生产脂肪酸及衍生生物燃料的代谢工程19-25
• 1.3.1 脂肪酸和脂肪醇分析方法19-20
• 1.3.2 微生物生产生物燃料的研究进展20-22
• 1.3.3 大肠杆菌生产脂肪醇的研究进展22-25
• 1.4 合成生物学应用于大肠杆菌代谢工程25-28
• 1.4.1 合成启动子应用于大肠杆菌代谢工程25-26
• 1.4.2 密码子优化应用于大肠杆菌代谢工程26-27
• 1.4.3 RBS计算应用于大肠杆菌代谢工程27-28
• 1.5 本论文研究的目的及工作设想28-31
• 2 串联重复序列辅助的大肠杆菌基因组编辑方法31-55
• 2.1 引言31-32
• 2.2 实验材料32-38
• 2.2.1 试剂与仪器32-34
• 2.2.2 引物、菌株和质粒34-37
• 2.2.3 培养基37-38
• 2.2.4 主要溶液38
• 2.3 试验方法38-48
• 2.3.1 大肠杆菌热激感受态的制备与转化38-39
• 2.3.2 大肠杆菌电转化感受态的制备与转化39-40
• 2.3.3 抗性标记基因的删除40
• 2.3.4 基因组无痕编辑40-46
• 2.3.4.1 cat-sacB片段制备40-41
• 2.3.4.2 基因无痕敲除41-42
• 2.3.4.3 基因无痕替换42-44
• 2.3.4.4 基因无痕插入44-46
• 2.3.5 基因组无痕编辑过程的优化46-48
• 2.3.5.1 蔗糖加入时刻的优化46-47
• 2.3.5.2 在蔗糖培养基中传代次数的优化47
• 2.3.5.3 转接时间的优化47-48
• 2.4 结果与讨论48-53
• 2.4.1 cat-sacB片段的构建48
• 2.4.2 基因删除48-50
• 2.4.3 基因替换和插入50-51
• 2.4.4 基因组无痕编辑过程的优化51-53
• 2.4.4.1 蔗糖加入时刻对重组率的影响51-52
• 2.4.4.2 传代次数对重组率的影响52-53
• 2.4.4.3 传代时刻对重组率的影响53
• 2.5 小结53-55
• 3 发酵液中脂肪酸和脂肪醇的分析55-75
• 3.1 引言55
• 3.2 材料和方法55-58
• 3.2.1 试剂与仪器55-57
• 3.2.2 菌株和质粒57
• 3.2.3 培养基57-58
• 3.3 试验方法58-62
• 3.3.1 标准品的准备58
• 3.3.2 液相分析方法的优化58-60
• 3.3.2.1 流动相比例的优化58-59
• 3.3.2.2 流动相流速的优化59
• 3.3.2.3 色谱柱温度的优化59-60
• 3.3.3 标准曲线和检测线的测定60
• 3.3.4 提取方法的优化60-61
• 3.3.5 分析方法的准确性和实用性分析61-62
• 3.3.5.1 提取方法加样回收率分析61
• 3.3.5.2 分析方法稳定性分析61-62
• 3.3.5.3 分析方法实用性分析62
• 3.4 结果与讨论62-74
• 3.4.1 HPLC-RID的参数选择62-65
• 3.4.1.1 流动相组成63-64
• 3.4.1.2 流速对检测结果的影响64
• 3.4.1.3 柱温对检测结果的影响64-65
• 3.4.2 标准品的测定65-66
• 3.4.3 利用正交试验优化提取过程66-70
• 3.4.4 分析方法应用分析70-74
• 3.4.4.1 加样回收率测定70-71
• 3.4.4.2 分析方法稳定性检验71-72
• 3.4.4.3 分析方法应用研究72-74
• 3.5 小结74-75
• 4 脂肪酸饥饿强化脂肪醇合成75-91
• 4.1 引言75-76
• 4.2 材料和方法76-80
• 4.2.1 试剂与仪器76-78
• 4.2.2 本章所用引物、菌株和质粒78-79
• 4.2.3 培养基79-80
• 4.3 试验方法80-82
• 4.3.1 海洋杆菌基因组的制备80
• 4.3.2 脂酰还原酶表达载体的构建80-81
• 4.3.3 副产物代谢路径基因的删除81
• 4.3.4 发酵菌株的构建81-82
• 4.3.5 酯解酶删除对菌体生长的影响的测定82
• 4.3.6 酯解酶删除对菌体转录组的影响测定82
• 4.3.7 工程菌株摇瓶发酵和脂肪醇产量检测82
• 4.3.8 最优菌株发酵罐发酵和脂肪醇产量的检测82
• 4.4 结果与讨论82-89
• 4.4.1 酯解酶分别删除对菌体的影响82-84
• 4.4.2 酯解酶连续删除对脂肪醇生产的影响84-85
• 4.4.3 酯解酶删除对工程菌株代谢流的影响85-87
• 4.4.4 副产物代谢路径基因的删除对脂肪醇生产的影响87-88
• 4.4.5 脂肪醇生产的补料发酵88-89
• 4.5 小结89-91
• 5 核糖体结合序列改造强化脂肪醇合成91-103
• 5.1 引言91
• 5.2 材料和方法91-93
• 5.2.1 主要试剂与仪器91
• 5.2.2 引物,菌株和质粒91-93
• 5.2.3 培养基93
• 5.3 试验方法93-95
• 5.3.1 RBS的计算93
• 5.3.2 RBS的整合93-95
• 5.3.3 发酵培养基与发酵条件95
• 5.3.4 脂肪醇产量的检测95
• 5.4 结果与讨论95-101
• 5.4.1 fabH RBS区的改造菌株的构建95
• 5.4.2 fabH RBS区的改造对脂肪醇产量的影响95-97
• 5.4.3 fabZ RBS区的改造菌株的构建97
• 5.4.4 fabZ RBS区的改造对脂肪醇产量的影响97-98
• 5.4.5 fabH fabZ RBS区同时改造菌株的构建98-99
• 5.4.6 fabH、fabZ RBS区同时改造对脂肪醇产量的影响99-100
• 5.4.7 菌株MGLHZS/pL1的补料发酵结果100-101
• 5.5 小结101-103
• 6 结论与展望103-107
• 6.1 主要结论103-104
• 6.2 创新之处104
• 6.3 今后的工作建议104-107
• 生化名词缩写表107-109
• 参考文献109-119
• 附件119-131
• 个人简历及发表文章目录131-133
• 致谢133

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