牡丹皮有效成分丹皮酚的提取及其药理作用的研究

发布时间：2017-09-04 14:21

  本文关键词：牡丹皮有效成分丹皮酚的提取及其药理作用的研究

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【摘要】：糖尿病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病之后第三大影响人类生活质量和健康的慢性疾病,其中有90%以上属于Ⅱ型糖尿病。目前,对于Ⅱ型糖尿病患者,临床上主要是采用肌肉注射胰岛素配合口服降糖药进行治疗。这种方法虽然可以缓解高血糖对人体带来的伤害,但是这些合成药物对机体普遍存在着不良反应和毒副作用,且患者需要终身服用,因此不可避免的对机体的主要器官(肝、肾等)造成严重损害乃至不得不停止用药。天然药物因具有毒副作用小,无明显不良反应的特点在糖尿病的治疗过程中受到了普遍的关注,并取得了一定的进展。丹皮酚(Paeonol)是一种传统中药,丹皮酚味苦性寒,入心、肝和肾三条经络,具有清热解毒、活血化瘀之功效,对多种疾病均有一定的治疗作用。目前研究已经证实,丹皮酚对于Ⅱ型糖尿病动物模型具有明显的治疗作用,能够有效降低糖尿病模型的血脂、血糖和高胰岛素血症,并且在临床应用中也取得了一定的疗效。然而,仍有许多工作亟需解决,如:从植物中经济高效的提取出具有生物活性的丹皮酚晶体、丹皮酚抗Ⅱ型糖尿病的具体作用机制还需进一步阐明。因此,本研究对丹皮酚的提取工艺进行了优化,并采用酶联免疫吸附试验、流式细胞技术、多聚酶链反应以及Western-blotting方法等,较为系统地研究了丹皮酚抗Ⅱ型糖尿病的具体作用及其机制。本试验采用盐水浸泡-水蒸气蒸馏法进行粗提,采用重结晶法进行纯化,从牡丹皮中提取出白色针状丹皮酚结晶,提取率为86.40%,经过分析鉴定为丹皮酚,纯度为95.21%。在动物试验过程中,采用链脲佐菌素结合高脂饲料制备Ⅱ型糖尿病大鼠模型,随机将动物分成正常组、模型组、丹皮酚低剂量组和高剂量组,对丹皮酚降血糖、血脂作用,缓解高胰岛素血症、丹皮酚对机体免疫功能的调节和对胰岛B细胞增殖分化的影响等方面进行了研究,获得如下结果:在给予糖尿病大鼠连续40天不同剂量丹皮酚灌胃治疗后,血糖从最初的16mmol/L左右下降到9.8mmol/L和7.0mmol/L,高剂量和低剂量组与模型组大鼠血糖相比均出现了显著性下降(p0.01),血清胰岛素也从33.75μIU/L分别下降到25.58μIU/L和19.96μIU/L,也出现了明显的降低(p0.01),接近正常大鼠的18.97μIU/L。同时,糖尿病大鼠的体重、血脂、糖化血红蛋白(Hb Alc)和葡萄糖耐量试验等也均出现明显改善,证明丹皮酚对Ⅱ型糖尿病具有很好的治疗效果。通过对丹皮酚治疗前后大鼠免疫功能的检测结果,丹皮酚可以显著升高Th1细胞的特征因子IL-2和TNF-α血清含量,即增强Th1细胞的整体活性,进而诱导CD8+细胞增殖分化,提高细胞免疫功能,增强胰岛B细胞的抵御伤害的能力,减少B的死亡。检测到血清中Th2的特征因子IL-6含量及基因表达显著降低,表明Th2的活性明显降低,即Th2诱导的体液免疫亢进受到有效抑制,Ig和C3、C4含量逐步恢复正常,减少对机体组织器官的损伤。另外丹皮酚还能升高血清中Treg细胞的特征因子TGF-β的含量及基因表达,通过增加Treg细胞的数量和活性,恢复CD4+/CD8+的比值,改善机体的特异性免疫。给予丹皮酚治疗40天后,胰腺组织HE染色结果显示,丹皮酚能够消除因糖尿病所致的胰腺组织内的免疫炎性反应,同时促进B细胞的增殖分化,参与受损胰岛修复和重建。通过研究发现丹皮酚具体作用机制,一方面能够促进胰腺组织内PPARγ表达显著增加,进而抑制JNK1凋亡信号通路,减少胰岛B细胞的进一步损伤,另一方面丹皮酚能够增强胰腺组织内GLP-1的表达,再通过GLP-1增强胰岛B细胞增殖分化路径中至关重要的因子PDX-1的表达,促进胰岛B细胞增殖分化,参与因糖尿病而受损的胰岛组织的重建与修复。
【关键词】：丹皮酚 Ⅱ型糖尿病 胰岛素抵抗 免疫功能 增殖分化
【学位授予单位】：燕山大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 绪论13-28
• 1.1 课题背景13-14
• 1.2 Ⅱ型糖尿病的病因与发病机制14-19
• 1.2.1 发病因素15-16
• 1.2.2 发病机制16-19
• 1.3 糖尿病治疗19-22
• 1.3.1 西药类治疗药物19-21
• 1.3.2 中药类治疗药物21-22
• 1.4 丹皮酚的药理作用22-26
• 1.4.1 丹皮酚的研究现状22-26
• 1.4.2 小结26
• 1.5 本文的主要研究内容和意义26-28
• 1.5.1 研究内容26-27
• 1.5.2 研究意义27-28
• 第2章 丹皮酚的分离、纯化和鉴定28-40
• 2.1 引言28
• 2.2 试验材料28-29
• 2.2.1 药品和试剂28-29
• 2.2.2 主要试验仪器29
• 2.3 试验方法29-32
• 2.3.1 牡丹皮样品中丹皮酚的含量测定29-30
• 2.3.2 丹皮酚的提取30-31
• 2.3.3 丹皮酚的纯化31
• 2.3.4 牡丹皮提取物丹皮酚的鉴定及纯度检测31-32
• 2.3.5 数据处理32
• 2.4 试验结果32-36
• 2.4.1 牡丹皮中丹皮酚含量测定结果32
• 2.4.2 盐水浸泡-水蒸汽蒸馏法提取丹皮酚结果32-36
• 2.5 讨论36-38
• 2.5.1 牡丹根皮中丹皮酚的提取和纯化36-38
• 2.5.2 牡丹皮中提取物质-丹皮酚的鉴定38
• 2.6 本章小结38-40
• 第3章 丹皮酚对II型糖尿病大鼠降糖作用的研究40-54
• 3.1 引言40
• 3.2 试验材料40-41
• 3.2.1 试验试剂与药品40-41
• 3.2.2 主要试验仪器41
• 3.2.3 试验动物41
• 3.3 试验方法41-44
• 3.3.1 试验用糖尿病大鼠模型的制备及分组41-42
• 3.3.2 确定动物的给药剂量42
• 3.3.3 丹皮酚降糖效果的检测42-43
• 3.3.4 丹皮酚对实验动物血脂影响的检测43
• 3.3.5 实验动物体重及肝、胰腺、脾脏和肾脏重量的测量43
• 3.3.6 试验动物血清胰岛素水平的检测43-44
• 3.3.7 数据统计44
• 3.4 试验结果44-48
• 3.4.1 II糖尿病大鼠模型的建立及评价44-45
• 3.4.2 大鼠葡萄糖耐受量检测结果45
• 3.4.3 丹皮酚降糖效果测定结果45-46
• 3.4.4 实验动物血脂检测结果46-47
• 3.4.5 大鼠肝脏、胰腺、脾脏和肾脏重量变化结果47
• 3.4.6 血清胰岛素和Hb A1c检测结果47-48
• 3.5 讨论48-53
• 3.5.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立48-49
• 3.5.2 丹皮酚对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响49-50
• 3.5.3 丹皮酚对大鼠肝脏、肾脏、胰腺和脾脏重量的影响50-51
• 3.5.4 丹皮酚影响Hb A1c含量变化的意义51-52
• 3.5.5 丹皮酚影响血清胰岛素含量变化意义52-53
• 3.6 本章小结53-54
• 第4章 丹皮酚对II型糖尿病大鼠的免疫调节作用54-76
• 4.1 引言54-55
• 4.2 材料55-57
• 4.2.1 实验动物55
• 4.2.2 实验试剂55-56
• 4.2.3 主要试验仪器56-57
• 4.3 试验方法57-62
• 4.3.1 糖尿病大鼠模型的建立57
• 4.3.2 试验动物分组及丹皮酚给药方案57
• 4.3.3 大鼠脾脏重量指数的测定57
• 4.3.4 大鼠血常规检测57-58
• 4.3.5 大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验58
• 4.3.6 淋巴细胞增值率测定(MTT法)58
• 4.3.7 大鼠外周血T淋巴细胞亚群的检测(流式细胞技术)58-59
• 4.3.8 大鼠外周血中免疫球蛋白及补体C3、C4 的检测59
• 4.3.9 大鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-2、TNF-α和TGF-β的检测59
• 4.3.10 大鼠外周血淋巴细胞中IL-6、IL-2、TNF-α和TGF-β m RNA的表达59-62
• 4.3.11 统计学分析62
• 4.4 试验结果62-69
• 4.4.1 各组大鼠血糖、血脂、糖化血红蛋白和胰岛素含量变化62-63
• 4.4.2 脾指数检测结果63-64
• 4.4.3 大鼠血常规白细胞比例检测结果64-65
• 4.4.4 大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能检测结果65
• 4.4.5 大鼠淋巴细胞增值率65-66
• 4.4.6 流式细胞仪T淋巴细胞亚群检测结果66
• 4.4.7 免疫球蛋白及补体C3、C4 检测结果66-67
• 4.4.8 大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-2、TNF-α和TGF-β检测结果67
• 4.4.9 大鼠血中总m RNA的提取及鉴定结果67-68
• 4.4.10 各组大鼠血中IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β m RNA的表达结果68-69
• 4.5 讨论69-75
• 4.5.1 丹皮酚对糖尿病大鼠免疫功能的调节作用69-70
• 4.5.2 丹皮酚对糖尿病大鼠T淋巴细胞亚群的影响70-71
• 4.5.3 丹皮酚对糖尿病大鼠血清中免疫球蛋白及补体的影响71-73
• 4.5.4 丹皮酚对糖尿病大鼠血清中炎性因子含量及表达的影响作用73-75
• 4.6 本章小结75-76
• 第5章 丹皮酚对胰岛B细胞增殖分化作用的研究76-93
• 5.1 引言76-77
• 5.2 试验材料77-78
• 5.2.1 试验动物77
• 5.2.2 试验试剂77-78
• 5.2.3 试验器械78
• 5.3 试验方法78-84
• 5.3.1 动物分组、模型制备及给药方案78
• 5.3.2 体重和血糖检测78
• 5.3.3 大鼠血清中胰岛素含量检测78-79
• 5.3.4 大鼠胰腺组织病理变化检测79-80
• 5.3.5 检测大鼠胰腺组织相关m RNA的表达变化80-81
• 5.3.6 胰腺组织中PPARγ、GLP-1、PDX-1、P-JNK、JNK蛋白含量检测81-84
• 5.3.7 数据分析84
• 5.4 试验结果84-88
• 5.4.1 HE染色结果84-85
• 5.4.2 Western-Boltting检测蛋白表达85-87
• 5.4.3 RT-PCR检测m RNA的表达结果87-88
• 5.5 讨论88-92
• 5.5.1 丹皮酚对PPARγ和JNK1 的影响89-91
• 5.5.2 丹皮酚对GLP-1 和PDX-1 的影响91-92
• 5.6 本章小结92-93
• 结论93-94
• 创新点及展望与设想94-95
• 参考文献95-106
• 附录106-108
• 攻读博士学位期间承担的科研任务与主要成果108-110
• 致谢110-111
• 作者简介111

【参考文献】

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本文编号：792027