基于抗独特型纳米抗体的桔霉素绿色免疫分析的研究

发布时间：2017-09-14 05:27

  本文关键词：基于抗独特型纳米抗体的桔霉素绿色免疫分析的研究

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【摘要】：桔霉素(Citrinin,CIT)是由青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和红曲霉属(Monascus)中的丝状霉菌代谢产生的一种真菌毒素,对人和动物具有较强的毒性作用。广泛存在于粮谷类及红曲发酵制品等食物中。鉴于桔霉素在各类食品中的污染水平及居民膳食中的暴露量,部分国家已制定了红曲制品中CIT的限量标准。目前,应用于检测CIT的方法主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、免疫分析法以及电化学传感器等。相比较而言,免疫分析法基于抗原抗体特异性识别,具有检测灵敏度高、选择性好、样品前处理简单、耗时短、成本低等优势。适合于食品安全监测过程中的大样本快速筛检。然而该方法的建立与应用,需使用大量CIT标准物及有机溶剂合成检测抗原,同时还需CIT标准物建立标准曲线,对操作人员的健康具有潜在的危害。若含有毒素标准物的废液处理不当,还可能造成实验室及环境的二次污染问题。本研究针对上述问题,将抗独特型纳米抗体应用于CIT的分子模拟,研制出CIT替代抗原,并建立了CIT绿色免疫学分析技术,降低了CIT对操作人员的危害及对环境造成的污染,为CIT污染的监控提供了灵敏、快速、简便、成本低、环保的新方法。本论文的主要研究内容和创新点如下:1首次从羊驼天然纳米抗体文库中淘选获得CIT替代抗原的抗独特型纳米抗体,研究建立了基于纳米抗体替代抗原的免疫分析技术,为其他小分子生物毒素等毒性污染物的绿色免疫分析研究提供了新的技术平台。1.1 CIT噬菌体ELISA方法的建立(P-ELISA)。经过四轮亲和淘选,从羊驼天然纳米抗体文库中获得一株可与CIT单克隆抗体4G6可变区特异性结合的纳米抗体X27,并建立了噬菌体展示纳米抗体作为替代竞争抗原的ELISA。对包被抗体浓度、噬菌体投入量、甲醇浓度、p H值、盐离子浓度等参数的优化后。该方法对CIT检测的IC50值为10.9 ng/m L,线性范围为2.5~100.0μg/kg,与常见真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)无交叉反应;对大米和面粉两种空白样品加标回收率分别在82.0~100.3%和79.2~110.1%之间;对谷类样品进行检测,与传统ELISA比较,检测结果一致。1.2基于纳米抗体替代包被抗原ELISA方法的建立(V-ELISA)。对X27纳米抗体进行表达纯化。该抗体可特异性结合CIT抗体4G6,与其他抗真菌毒素抗体无交叉反应;经棋盘滴定优化了纳米抗体包被浓度和抗体工作浓度,建立了以X27纳米抗体为包被抗原的V-ELISA方法,并对反应体系的甲醇浓度进行了优化。该方法对CIT检测的IC50值为44.6 ng/m L,线性范围为5.0~300.0μg/kg,方法与四种常见真菌毒素(AFB1、OTA、ZEN、DON)无交叉反应;大米和面粉两种空白样品加标回收率分别在82.7~101.5%和83.7~115.6%之间;分别采用V-ELISA与传统ELISA对红曲发酵大米样品进行检测,两种方法检测结果一致,表明本研究建立的基于纳米抗体替代包被抗原的ELISA方法可应用于红曲制品中CIT的污染监测。1.3抗原抗体结合动力学参数的分析。采用生物薄膜光干涉技术(BLI)分别对X27纳米抗体与CIT抗体4G6及CIT人工合成抗原与抗体的结合动力学参数进行测定。CIT模拟抗原X27纳米抗体与抗体的平衡解离常数KD值为160 n M,而CIT人工合成抗原的KD值为68 n M。基于CIT模拟抗原较低的亲和力,V-ELISA展示出比传统ELISA更高的灵敏度。2成功构建双峰骆驼天然纳米抗体文库,并将淘选获得的不同亲和力的抗独特型纳米抗体分别作为CIT标准物替代品和CIT包被抗原,研究建立了基于纳米抗体的无毒免疫分析方法。2.1成功构建双峰骆驼天然纳米文库。提取未经免疫的双峰骆驼外周血淋巴细胞RNA,采用单域重链抗体铰链区特异性引物,克隆获得大小在500bp左右的重链可变区片段(VHH)。再将扩增得到的VHH片段连接到噬菌粒载体p HEN1上,电转化大肠杆菌TG1,获得库容量为5.0×108的骆驼天然纳米抗体基因文库,经M13K07辅助噬菌体救援获得滴度为1.2×1013 c.f.u/m L的纳米抗体噬菌体展示库。2.2以抗CIT单克隆抗体4G6为靶标进行固相亲和淘选。采用Gly-HCl(p H 2.2)洗脱法结合CIT标准物竞争洗脱法,对骆驼天然纳米抗体亲和淘选。获得5种不同序列的克隆可与CIT竞争结合CIT单克隆抗体4G6。5种纳米抗体展现出不同的亲和力,其中C1与CIT抗体4G6的亲和力最高,KD值为38.4 n M。此外,纳米抗体C1在70℃下处理20 min仍保持良好活性,具有较高的热稳定性。2.3基于抗独特型纳米抗体的无毒ELISA方法的建立。以纳米抗体A9为包被抗原,分别建立CIT标准物及纳米抗体C1替代CIT标准物的标准曲线。在相同的抑制率下,纳米抗体C1浓度与CIT标准物浓度具有良好的线性相关,线性相关方程为y=49.404x-10.395(R2=0.9977),其中y为CIT浓度,x为纳米抗体C1浓度。采用两步法计算样品中CIT含量,首先根据样品检测的抑制率计算替代标准物的纳米抗体C1浓度,然后通过C1浓度与CIT的线性相关方程,再转换为样品中CIT含量。选取了8份红曲发酵大米的样品,采用无毒ELISA法进行检测,与高效液相色谱法检测结果进行比较,相关系数R2值为0.957。因此,本研究研制的基于抗独特型纳米抗体的绿色无毒ELISA能够应用于实际样品中CIT污染的检测。
【关键词】：桔霉素 骆驼科 抗独特型抗体 纳米抗体 分子模拟 绿色免疫分析
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS207.3;TB383.1
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-10
• 缩略语10-15
• 第1章 前言15-38
• 1.1 桔霉素免疫分析技术研究进展15-21
• 1.1.1 桔霉素概述15-17
• 1.1.2 桔霉素免疫分析技术17-20
• 1.1.3 桔霉素免疫分析的发展趋势20-21
• 1.2 绿色免疫分析技术研究进展21-36
• 1.2.1 绿色免疫分析概述21-22
• 1.2.2 噬菌体随机多肽展示技术22-23
• 1.2.3 噬菌体随机多肽展示技术在抗原表位模拟中的应用23-24
• 1.2.4 抗独特型抗体24-28
• 1.2.5 纳米抗体28-35
• 1.2.6 抗独特型纳米抗体35-36
• 1.3 主要研究内容和意义36-38
• 1.3.1 研究内容36
• 1.3.2 研究意义36-38
• 第2章 抗独特型纳米抗体替代抗原的绿色免疫分析研究38-70
• 2.1 材料、仪器与试剂38-41
• 2.1.1 主要材料38
• 2.1.2 主要仪器38-39
• 2.1.3 主要溶液和培养基39-41
• 2.2 方法与步骤41-49
• 2.2.1 羊驼天然纳米抗体基因文库噬菌粒的救援与滴度测定41
• 2.2.2 抗独特型纳米抗体的淘选与鉴定41-43
• 2.2.3 桔霉素Phage-ELISA(P-EILSA)的建立43-44
• 2.2.4 桔霉素P-ELISA的验证44
• 2.2.5 抗独特型纳米抗体的表达与纯化44-47
• 2.2.6 抗独特型纳米抗体替代CIT包被抗原V-ELISA的建立47
• 2.2.7 V-ELISA在实际样品检测的应用47-48
• 2.2.8 抗独特型纳米抗体及CIT抗原与单克隆抗体 4G6的亲和力48-49
• 2.3 结果与分析49-66
• 2.3.1 抗独特型纳米抗体的亲和淘选49
• 2.3.2 阳性克隆的鉴定49-50
• 2.3.3 桔霉素phage-EISA(P-ELISA)的建立50-57
• 2.3.4 抗独特型纳米抗体的表达和纯化57-59
• 2.3.5 抗独特型纳米抗体替代包被抗原ELISA（V-ELISA）的建立59-65
• 2.3.6 亲和力分析65-66
• 2.4 讨论66-69
• 2.4.1 抗独特型纳米抗体的制备66
• 2.4.2 纳米抗体的原核表达66-67
• 2.4.3 基于抗独特型纳米抗体的CIT免疫分析方法67-68
• 2.4.4 抗独特型纳米抗体在小分子半抗原模拟研究中的优势68-69
• 2.5 小结69-70
• 第3章 抗独特型纳米抗体替代CIT标准物的绿色无毒免疫分析研究70-97
• 3.1 材料、仪器和试剂70-71
• 3.1.1 主要材料与试剂70
• 3.1.2 主要仪器70
• 3.1.3 主要溶液和培养基70-71
• 3.1.4 PCR引物71
• 3.2 方法与步骤71-78
• 3.2.1 骆驼天然纳米抗体文库的构建71-76
• 3.2.2 抗独特型纳米抗体的淘选与鉴定76
• 3.2.3 抗独特型纳米抗体的表达纯化76-77
• 3.2.4 抗独特型纳米抗体的验证77
• 3.2.5 抗独特型纳米抗体与CIT单抗结合动力学分析77
• 3.2.6 抗独特型纳米抗体的热稳定性77
• 3.2.7 CIT无毒ELISA的建立77-78
• 3.2.8 实际样品检测的应用78
• 3.3 结果与分析78-92
• 3.3.1 骆驼天然纳米抗体文库的构建及鉴定78-81
• 3.3.2 抗独特型纳米抗体的亲和淘选81-82
• 3.3.3 阳性克隆的鉴定82-84
• 3.3.4 阳性克隆P-ELISA检测CIT竞争标准曲线的建立84
• 3.3.5 抗独特型纳米抗体的性质鉴定84-86
• 3.3.6 抗独特型纳米抗体与CIT单抗亲和力的分析86-88
• 3.3.7 抗独特型纳米抗体C1的热稳定性88
• 3.3.8 CIT无毒绿色免疫分析方法的建立88-91
• 3.3.9 方法在实际样品检测的应用91-92
• 3.4 讨论92-96
• 3.4.1 纳米抗体基因文库的构建92-93
• 3.4.2 抗独特型纳米抗体的应用93-94
• 3.4.3 抗原抗体亲和力与竞争免疫分析方法灵敏度的关系94
• 3.4.4 纳米抗体亲和力的改造94-96
• 3.5 小结96-97
• 第4章 结论与展望97-100
• 4.1 结论97-98
• 4.2 展望98-100
• 参考文献100-112
• 附录A 氨基酸基本信息表112-113
• 致谢113-114
• 攻读博士学位期间的研究成果114

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本文编号：848143