低温胁迫下小胸鳖甲的转录组分析及差异表达基因几丁质酶的初步研究

发布时间：2017-11-24 16:12

  本文关键词：低温胁迫下小胸鳖甲的转录组分析及差异表达基因几丁质酶的初步研究

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【摘要】：小胸鳖甲(Microdera punctipennis)隶属于鞘翅目拟步甲科,是分布于中国西北地区古尔班通古特沙漠的“指示生物”之一。荒漠地区生境严酷,尤其是昼夜温差和季节温差极大。拟步甲科昆虫是分布于该区域的优势种群,有极强的抗干旱、抗高温及抗冻等多种抗逆性,因此,具有多种抗逆基因和分子机制可待发掘和利用。已经发现昆虫抗冻蛋白基因(Antifreeze protein,afp)及热激蛋白基因(Heat shock protein,hsp)等众多基因在其适应荒漠环境的分子机制中发挥重要作用。随着新技术的不断发展,有助于发现更多新的参与昆虫环境适应性的基因和信号途径。本文采用Illumina高通量测序技术分别对4°C处理3 h(CD)和未经低温处理(CK)的小胸鳖甲成虫进行转录组测序,获得了该昆虫大量的差异表达基因信息,分析了其响应低温胁迫的转录水平变化,从宏观角度探讨了基因表达变化在昆虫低温胁迫响应过程中发挥的作用;此外,对低温诱导后表达水平显著上调的几丁质酶基因进行表达和初步的功能分析。主要取得如下结果:(1)正常对照组(CK)的转录组基础数据分析:未经处理小胸鳖甲成虫的转录组数据通过组装拼接最终获得56,348个unigene,平均长度为666 bp。与已知蛋白数据库比对后发现41,109个unigene(72.96%)与已知蛋白序列高度相似(E-value10-5)。此外,对unigene进行GO、COG/KOG和KEGG的功能注释、分类或代谢通路分析,结果显示大部分基因与环境胁迫相关,包括编码热激蛋白hsp、抗冻蛋白afp基因,此外还有一些酶类如几丁质酶、海藻糖酶和海藻糖-6-磷酸合成酶等。(2)低温处理组(CD)和正常对照组(CK)的转录组基础数据分析:对小胸鳖甲成虫低温胁迫与正常对照两个转录组数据合并后进行拼接组装,发现所获得的所有144,777个unigene的平均长度为463 bp。对所有unigene进行BLASTX搜索(E10-5)发现共有51,447个unigene(35.54%)与蛋白质数据库中的已知序列同源,还有大量unigene(64.46%)未能注释,这是由于大多数较短unigene(300 bp)不能通过BLASTX比对获得同源序列信息。大量已知及未知功能基因的获得,扩充了昆虫低温特异性表达基因的数目,充分显示出转录组测序手段在基因序列数据挖掘上的巨大潜力,为深入研究荒漠昆虫的低温响应机制奠定了基础。(3)转录组差异表达基因分析:对两组样品转录组之间的差异表达基因进行统计分析,结果表明共有92,010个unigene的表达水平发生了变化,其中有48,416个unigene上调,43,594个下调。go功能富集分析发现具有水解酶活性的(go:0016787)unigene数量最多,其中1,231个水解酶活性相关的unigene上调表达。利用goslim功能富集分析发现,低温胁迫下部分unigene的生物学功能集中在对非生物胁迫的响应方面,包括对温度应激响应(go-id:9266),胁迫响应(go-id:6950),热激响应(go-id:9408),氧化胁迫应激响应(go-id:6979)以及体温调节(go-id:43052)等生物学过程。与温度相关的unigene包括丝裂原激活蛋白激酶激酶mkk7(mitogen-activatedproteinkinasekinase7)、组氨酸脱羧酶hdc(histidinedecarboxylase)、分子伴侣dnaj(molecularchaperonednaj)、热激蛋白hspa5/bip(heatshockprotein5)、神经纤维瘤蛋白1nf1(neurofibromin1)等。所获得的所有unigene中,在两组样品中共表达的有38,667个,仅在低温处理组中特异性表达的unigene有28,678个,仅在正常对照组中特异性表达的unigene有24,671个,这在一定程度上表明不同的基因在低温条件下其表达存在着时空特异性。采用real-timepcr技术验证了13个表达差异基因在4oc低温处理3h后的表达水平变化,其结果和转录组差异表达结果基本一致。对低温响应相关基因的挖掘和鉴定将为后续的功能研究提供基础数据。(4)最显著的差异表达基因—几丁质酶基因mpcht12抗血清的制备:在水解酶活性相关unigene分析中发现,几丁质酶基因是小胸鳖甲成虫低温转录组中表达变化最为显著的类群之一,共有106个序列被注释为几丁质酶(e3.2.1.14),其中一个几丁质酶基因(unigeneidno.786seq1)受低温诱导表达水平显著升高,系统进化树分析该基因编码的蛋白质属于iv型昆虫几丁质酶,命名为mpcht12。构建真核表达载体pcdna3-mpcht12,rt-pcr检测其在小鼠肝脏特异性表达。构建原核表达载体pet30a-mpcht12并表达纯化获得重组蛋白his-mpcht12。对昆明白小鼠采用核酸初免—蛋白加强的免疫方法,经pcdna3-mpcht12质粒免疫后,再用his-mpcht12融合蛋白加强免疫,收集血清,通过westernblot和elisa检测,结果表明抗血清效价高达1:204800。(5)mpcht12基因的表达模式及功能初步分析:mrna水平上mpcht12基因在小胸鳖甲成虫不同组织的表达水平为:脂肪体后肠前肠体壁中肠,其中脂肪体的表达水平约为中肠的10倍,免疫组化结果显示MpCHT12在脂肪体和中肠都有表达。低温处理的表达谱分析结果显示,该基因在4oC处理下7 h后的表达上调最为显著。应用STRING在线软件对MpCHT12进行蛋白互作网络分析,共预测到22个与MpCHT12有互作关系的蛋白,其中预测到7个与MpCHT12有直接互作关系的蛋白,包括类N乙酰D-葡萄糖激酶,β类氨基己糖苷酶B,类β氨基己糖苷酶亚基α,类氨基己糖苷酶A,fused lobes(FDL),β-N乙酰葡糖胺糖苷酶NAG2和氨基己糖苷酶NAG1。Mpcht12基因的低温表达模式说明其可能在小胸鳖甲低温适应中发挥作用,互作网络关系分析对于小胸鳖甲成虫低温胁迫下分子机制的深入研究有提示作用。(6)6个差异表达几丁质酶基因的组织及低温表达模式分析:对小胸鳖甲低温转录组中获得的6个差异表达几丁质酶基因(394seq2,1184seq1,19417seq2,200seq3,5176seq3和7762seq6)进行鉴定和表达模式分析。根据系统进化树结果显示,6个几丁质酶基因分别属于3种不同的类型。组织特异性分析结果显示几乎所有基因都在中肠高表达,个别在脂肪体和后肠中也有表达。 4oC处理不同时间几丁质酶基因的整体表达水平高于4oC处理不同时间后几丁质酶基因的表达水平。小胸鳖甲几丁质酶基因以多基因家族形式存在。几丁质酶的组织特异性表达和低温诱导表达说明其可能有多重功能且在昆虫的低温适应机制中发挥重要作用。
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q963

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