CACUL1调节骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的分子机制研究

发布时间：2020-11-16 23:35

　　 随着我国人口老龄化程度日趋严重,骨质疏松症已成为我国面临的重要公共健康问题。目前临床常用的治疗骨质疏松症药物多为抗骨吸收药物,促骨形成药物较少。因此,进一步深入开展骨质疏松症发生机制的基础研究,以寻求更多有效的促骨形成药物,具有非常重要的临床诊疗价值。细胞周期素依赖激酶2相关性Culin结构域1(CDK2-associated cullin1,CACUL1)是一个与细胞周期调控密切相关的基因,最近研究发现CACUL1通过抑制成脂标志物PPARγ,从而抑制3T3-L1细胞向脂肪细胞转化。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)同3T3-L1细胞一样,都是脂肪细胞的前体细胞,都具有成脂分化的能力。如果CACUL1在BMSCs中也具有相同的抑制成脂分化能力,那么CACUL1即可促进BMSCs向成骨细胞分化,从而发挥抗骨质疏松症的作用。因此,本课题从以下三部分内容进行研究:(1)利用GEO数据库的基因芯片数据,分析CACUL1基因在骨质疏松症患者和正常人BMSCs内表达上的差异;通过临床收集骨质疏松性骨折患者和正常骨折患者的骨髓组织,验证CACUL1基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低;(2)通过培养大鼠BMSCs,分析成脂、成骨分化过程中CACUL1的表达变化趋势;构建腺病毒过表达及沉默CACUL1载体,研究CACUL1对BMSCs成脂、成骨分化的影响;(3)分析CACUL1在BMSCs成骨分化过程中的作用及分子机制。第一部分CACUL1在骨质疏松患者BMSCs中的表达研究目的:通过生物信息学分析CACUL1在骨质疏松症患者和正常人BMSCs中表达差异,明确CACUL1在骨质疏松患者BMSCs中表达降低;通过临床收集骨质疏松性骨折患者和正常骨折患者的骨髓组织,验证CACUL1基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低。方法:GEO数据库检索并下载基因芯片GSE35958的原始数据,使用基于R语言的Bioconductor软件对数据进行预处理及分析,明确CACUL1在骨质疏松患者BMSCs中表达降低。根据纳入排除标准招募骨质疏松性骨折和正常骨折患者各6人;在骨折复位手术中采集扩孔器上残余的骨髓组织,分离培养BMSCs,使用Western blotting实验检测CACUL1蛋白的表达,验证CACUL1基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低。结果:对基因芯片GSE35958的数据进行分析后,共筛选出差异表达基因805个,CACUL1在骨质疏松症患者BMSCs中表达较对照组降低3.5倍。Western Blotting结果显示,骨质疏松症患者BMSCs中CACUL1的表达较正常对照组低。结论:CACUL1在骨质疏松症患者BMSCs中的表达较正常人降低,CACUL1可能在骨质疏松症的发生、发展中发挥重要作用。第二部分CACUL1对BMSCs成脂、成骨分化的作用研究目的:研究CACUL1基因在大鼠BMSCs成脂和成骨分化早期阶段的表达趋势;利用腺病毒沉默或过表达CACUL1,研究CACUL1对BMSCs成脂和成骨分化的作用。方法:使用经典的成脂和成骨诱导方案分别诱导SD大鼠BMSCs,诱导后1d、2d、3d、4d和5d时qRT-PCR和Western blotting方法检测CACUL1的表达。通过腺病毒载体分别沉默和过表达CACUL1基因,检测成脂分化的标志物PPARγ2、LPL和FABP4以及成骨分化的标志物RUNX2、OCN和OPN,明确CACUL1基因对BMSCs成脂和成骨分化的作用。结果:CACUL1 mRNA和蛋白表达在成脂诱导分化后5d下降,而在成骨诱导分化后5d显著增加。沉默CACUL1上调成脂分化的标志物PPARγ2、LPL和FABP4的mRNA和蛋白表达,下调成骨分化的标志物RUNX2、OCN和OPN的mRNA和蛋白表达。过表达CACUL1抑制成脂分化标志物的表达,促进成骨分化标志物的表达。结论:CACUL1在BMSCs成脂分化早期表达降低,而在成骨分化早期表达增高;CACUL1能抑制BMSCs成脂分化,促进其成骨分化;CACUL1可能是BMSCs定向分化过程中的关键因子,其促骨形成作用,可能成为治疗骨质疏松症的重要潜在靶点。第三部分CACUL1在BMSCs成骨分化过程中的分子机制研究目的:分析CACUL1在BMSCs成骨分化过程中的分子机制。方法:通过腺病毒载体过表达CACUL1,使用Western blotting方法检测BMSCs成骨分化过程中p-ERK1/2及ERK1/2的表达;应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126后,Western blotting方法检测成骨分化的标志物RUNX2的表达。结果:腺病毒过表达CACUL1后,RUNX2蛋白表达升高,同时p-ERK1/2的表达也升高,而EKR1/2的表达不变。使用抑制剂U0126后,p-ERK1/2的表达降低,而成骨标志基因RUNX2也显著降低。结论:CACUL1通过激活ERK1/2信号通路促进BMSCs向成骨细胞分化,促进骨质形成;由于CACUL1的促成骨作用,可能成为治疗骨质疏松症药物的潜在靶点。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

基因芯片读取后,对所有基因的表达值取log2,可见各样本之间基因表达量不一(图1A)。通过参照管家基因对所有数据进行标准化校正,如图1B所示。2.2 CACUL1 基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低

使用limma包对基因芯片数据分析后,筛选出差异表达基因805个,其中骨质疏松患者表达上调的基因443个,表达下调的基因362个。骨质疏松组与对照组BMSCs中所有差异基因的表达见图2A。从筛选出的差异表达基因中查询CACUL1的表达水平,结果显示CACUL1在骨质疏松症患者BMSCs中表达较对照组降低3.5倍(logFC=-3.50177385,t=-4.75636821,P=0.000784128,adj.P.Val=0.05843856)。3 讨论

采用全骨髓贴培养法提取人BMSCs,48 h后显微镜下观察,培养瓶底部可见贴壁细胞,形态各异,有圆形、梭形和多角形;贴壁细胞多成集落分布,集落中心位置细胞较密;还可见大量不贴壁的悬浮细胞(图3A)。换液处理去除悬浮库细胞,通过多次换液传代,杂细胞数量减少,逐渐纯化为单一的BMSCs;P3代BMSCs形态为梭形,细胞之间呈放射状或典型的旋涡状排列(图3B)。2.2 人BMSCs的流式鉴定
【相似文献】

相关期刊论文 前1条

1 孔莺;亓小改;白沛松;南克俊;;细胞周期相关新基因CACUL1对培养的结直肠癌细胞凋亡的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年05期

相关博士学位论文 前1条

1 赵恩哲;CACUL1调节骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的分子机制研究[D];山西医科大学;2020年

本文编号：2886793