瑞氏木霉纤维素酶降解模式及其功能多样性研究

发布时间：2024-06-23 09:40

　　随着全球经济的发展,化石资源迅速地被消耗,能源、资源、环境问题已经成为制约人类社会经济和生态可持续发展的主要瓶颈。纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,是地球上最丰富的可再生碳源。纤维素的充分利用能够以可持续的方式缓解化石能源过度利用带来的环境危机。但是由于纤维素生物降解的生产成本过高,限制了资源的有效利用。为有效利用纤维素资源,构建高效纤维素降解酶系一直为研究的重点。目前普遍的观点认为纤维素酶系构成应主要由糖苷水解酶系、氧化酶系及辅助降解因子等组成。相对于外切纤维素酶及p-葡萄糖苷酶较为清晰的功能定位,酶系中往往存在多种内切纤维素酶,其功能与作用模式并没有得到很好的区分。同时,由于纤维素酶活测定使用底物衍生物和类似物并不能够全面反映酶系的活力,更不能确切反映纤维素酶系中各组分的角色与功能。因此,本文针对以上问题进行了较系统的研究,取得主要研究结果如下：1、通过对瑞氏木霉在14种不同碳源上糖苷水解酶的动态表达分析,发现瑞氏木霉纤维素酶系不同组分的表达分泌具有底物差异性。说明不同内切纤维素酶组分具有生理功能的差异性。对瑞氏木霉进行不同碳源下的分批培养,测定了其胞外外切纤维素酶、内切纤维素酶和...

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
第1章 绪论
    1.1 木质纤维素
        1.1.1 纤维素
        1.1.2 半纤维素
        1.1.3 木质素
    1.2 降解木质纤维素的真菌
    1.3 瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶系
        1.3.1 纤维素酶的种类
        1.3.2 不同酶组分之间的协同作用
        1.3.3 一种新的纤维素转化策略
    1.4 测定纤维素酶活的底物
        1.4.1 可溶性底物
        1.4.2 不溶性底物
    1.5 纤维素酶活性测定
        1.5.1 内切纤维素酶活性的测定
        1.5.2 外切纤维素酶活性的测定
        1.5.3 β-D-葡萄糖苷酶活性的测定
        1.5.4 总纤维素酶活的测定
    1.6 T. reesei的系统生物学研究
        1.6.1 T. reesei纤维素酶和半纤维素酶的基因组研究
        1.6.2 T. reesei基因组碳水化合物水解酶的分布
        1.6.3 T. reesei突变株基因组测序以确定影响纤维素酶生产的菌株
        1.6.4 T. reesei的转录组研究
        1.6.5 T. reesei的分泌组研究
        1.6.6 T. reesei的代谢组学研究
    1.7 立题依据
第2章 不同碳源下T. reesei胞外糖苷水解酶的分析研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌种
        2.1.2 培养基及试剂
        2.1.3 仪器与设备
        2.1.4 粗酶液的提取
        2.1.5 糖苷水解酶活性的测定
        2.1.6 糖苷水解酶谱及寡糖谱分析
        2.1.7 T. reesei功能蛋白质组学分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 不同碳源发酵粗酶液中还原糖测定以及寡糖谱分析
        2.2.2 T. reesei胞外糖苷水解酶活性的测定及动态酶谱分析
        2.2.3 T. reesei在不同的碳源上其功能蛋白组学分析
    2.3 小结与讨论
第3章 荧光辅助糖电泳技术与纤维素酶降解模式的分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 化学试剂
        3.1.2 再生无定形纤维素(RAC)底物的制备
        3.1.3 T. reesei的内切纤维素酶TrCel12A的异源表达
        3.1.4 内切纤维素酶ChCel5A的表达纯化
        3.1.5 T. reesei外切纤维素酶Ⅰ(TrCel7A)的纯化
        3.1.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
        3.1.7 酶解实验测定
        3.1.8 样品荧光标记
        3.1.9 电泳条件优化
        3.1.10 电泳数据定量提取
    3.2 结果与分析
        3.2.1 TrCel12A的异源表达
        3.2.2 ChCel5A的纯化
        3.2.3 TrCel7A的纯化
        3.2.4 利用FACE测定纤维寡糖的浓度
        3.2.5 利用FACE分析产物谱快速确定纤维素酶的种类
        3.2.6 利用时间过程的产物谱分析区分内切纤维素酶的降解模式
    3.3 小结与讨论
第4章 T.reesei不同内切纤维素酶不同降解机制的研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌株与质粒
        4.1.2 培养基及相关试剂
        4.1.3 菌种活化与培养
        4.1.4 T. reesei RNA提取及反转录
        4.1.5 内切纤维素酶基因克隆与重组质粒的构建
        4.1.6 EG Ⅰ的异源表达
        4.1.7 EG Ⅱ、EGⅣ的异源表达
        4.1.8 不同家族内切纤维素酶水解RAC与寡糖的FACE检测
        4.1.9 不同家族内切纤维素酶的生物信息学分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 内切纤维素酶基因的扩增
        4.2.2 内切纤维素酶的表达纯化
        4.2.3 内切纤维素酶水解RAC产物谱的FACE检测
        4.2.4 内切纤维素酶水解寡糖产物谱的FACE检测
        4.2.5 内切纤维素酶活性中心的结构与表面电势分析
        4.2.6 内切纤维素酶活性部位与糖环的相互作用分析
        4.2.7 内切纤维素酶结合寡糖的分子动力学模拟
    4.3 小结与讨论
第5章 荧光光谱测定纤维素酶与底物的结合能力
    5.1 材料与方法
        5.1.1 试剂
        5.1.2 主要仪器设备
        5.1.2 内切纤维素酶ChCel5A的表达纯化
        5.1.3 T. reesei外切纤维素酶Ⅰ(TrCel7A)的纯化
        5.1.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
        5.1.5 纤维素酶活性的测定
        5.1.6 荧光体荧光光谱的测定
        5.1.7 荧光体与pNP类底物结合的荧光光谱测定
    5.2 结果与分析
        5.2.1 荧光体自身荧光光谱的测定
        5.2.2 荧光光谱的淬灭与结合常数及结合能的计算
        5.2.3 使用荧光光谱的方法计算纤维素酶与底的结合常数以及结合自由能
    5.3 小结与讨论
全文总结与展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件



本文编号：3995326