表皮生长因子受体及多配体蛋白聚糖4在猪繁殖与呼吸综合征病毒入胞过程中的作用机制

发布时间：2017-12-22 04:34

  本文关键词：表皮生长因子受体及多配体蛋白聚糖4在猪繁殖与呼吸综合征病毒入胞过程中的作用机制　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,为有囊膜的单股正链RNA病毒,感染PRRSV可引起以母猪繁殖障碍、流产、死胎、木乃伊胎、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征的传染病。目前该病已在全球范围内传播,严重地威胁着世界养猪业的健康发展。以往的研究主要集中于对PRRSV感染与宿主免疫应答机制的探索,而对PRRSV的吸附及入胞的机制研究还不是很清楚。本研究主要针对PRRSV入胞过程中激活的信号通路和其分子机制的探讨,以及对PRRSV吸附受体的研究。主要研究内容包括:1.酪氨酸激酶在猪繁殖与呼吸综合征病毒入胞过程中作用的研究蛋白酪氨酸激酶介导许多胞内外信号的转导和处理,在肿瘤发生过程中,它们对调节细胞生长和分化起到关键的作用。我们研究了蛋白酪氨酸激酶在PRRSV入胞中的作用。结果表明,PRRSV入胞过程中激活Src和EGFR,并且用它们特异性抑制剂Genistein, PP2, SU6656和八G1478作用细胞后能显著抑制病毒的入胞,说明PRRSV利用酪氨酸激酶的活性来促进病毒入胞。并且Src与EGFR在MARC-145细胞中具有相互作用。我们又着重研究了 EGFR对PRRSV入胞的影响。结果发现,过表达EGFR或激活EGFR可促进PRRSV的入胞,而减少EGFR的表达或抑制EGFR的活性均使病毒入胞明显降低。这些结果表明,PRRSV激活Src和EGFR及其相关信号分子促进其进入MARC-145细胞。2. EGFR-PI3K/AKT-LIMK-cofilin信号通路参与猪繁殖与呼吸综合征病毒入胞的研究利用western blot、荧光定量PCR等技术分析PRRSV进入MARC-145细胞过程中激活的信号分子及通路。结果表明,PRRSV在进入细胞过程中可以激活包括PI3K、AKT、LIMK1和cofilin在内的信号分子,信号通路的激活有利于调节细胞骨架变化并介导病毒入胞。我们利用特异性抑制剂验证信号分子在通路中的上下游关系,结果发现,EGFR的特异性抑制剂AG1478可以抑制PI3K、AKT、LIMK1和cofilin的激活;PI3K的特异性抑制剂LY294002可以抑制AKT、LIMK1和cofilin的激活;ROCK特异性抑制剂Y27632可以抑制LIMK1和cofilin的激活。并且PI3K的特异性抑制剂LY294002和AKT特异性抑制剂Ⅷ及ROCK特异性抑制剂Y27632可以抑制病毒的入胞。干扰cofilin表达后病毒入胞显著降低;降低cofilin表达后再瞬时转染cofilin组成性激活突变体可部分回补病毒的入胞。我们的研究结果表明PRRSV入胞过程会激活EGFR/PI3K/AKT-LIMK1-cofilin信号通路,并利用该通路来促进病毒的入胞过程。3.多配体蛋白聚糖4在猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附和入胞机制中的研究进展我们对PRRSV进入MARC-145细胞过程中多配体蛋白聚糖4 (syndecan 4)的分布及作用进行了研究。结果表明,PRRSV在4℃与细胞孵育时syndecan4位于细胞的表面,而在病毒进入细胞过程中可以使syndecan 4内吞进入胞质中。通过试验我们发现,syndecan 4抗体可以抑制病毒的吸附,用syndecan 4特异性siRNA干扰掉syndecan 4后病毒吸附水平明显降低。并且,过表达syndecan 4后PRRSV的吸附和入胞均显著增加。为验证syndecan4与EGFR相互作用在病毒吸附和入胞中的作用,我们利用syndecan4的结合肽处理细胞,结果显示,病毒的入胞显著降低,而病毒的吸附没有显著变化,即syndecan 4与EGFR相互作用介导PRRSV的入胞。为验证EGFR对syndecan 4内吞的影响,我们利用免疫荧光方法发现,用EGFR特异性抑制剂AG1478和syndecan 4的结合肽处理细胞后能显著抑制病毒入胞诱导的syndecan 4的内吞。以上结果表明,PRRSV利用syndecan 4吸附在MARC-145细胞表面,并通过syndecan 4与EGFR的相互作用来介导病毒的入胞。4.多配体蛋白聚糖4在猪繁殖与呼吸综合征病毒入胞过程中介导的信号通路。用syndecan 4特异性siRNA干扰syndecan 4后能显著抑制病毒诱导的FAK、Src和EGFR的磷酸化。并且我们发现PRRSV入胞过程中激活钙结合蛋白Annexin A2(Anx A2 )。用Annexin A2特异性siRNA干扰Annexin A2后能显著抑制PRRSV的入胞,而过表达Annexin A2则能促进病毒的入胞,这表明Annexin A2参与PRRSV的入胞。而且,FAK特异性的抑制剂PF573228、Src抑制剂PP2及EGFR抑制剂AG1478能够显著抑制病毒诱导的Annexin A2的激活。干扰掉Annexin A2后,病毒入胞诱导的EGFR、Src和cofilin的磷酸化也减少,表明在PRRSV入胞过程中Annexin A2同样也能调节EGFR和Src的活性,并通过调节细胞骨架来介导病毒的入胞。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
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本文编号：1318472