人工靶向核酸酶活性鉴定及阳性编辑细胞富集系统优化研究

发布时间：2017-12-23 17:32

本文关键词：人工靶向核酸酶活性鉴定及阳性编辑细胞富集系统优化研究　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基因组编辑技术在过去的三十年间已经发生了巨大变化,从最开始的同源重组技术演变到核酸酶靶向切割产生双链断裂切口进而高效改造基因组。人工靶向核酸酶技术已经从锌指核酸酶(ZFNs)跨过转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)进而快速发展到成熟的第三代CRISPR/Cas9系统,这些基因组编辑技术的发展对细胞水平基因改造、动物个体水平基因功能研究及转基因动物生产和人类个体水平基因疾病治疗都起到了巨大推动作用。但是在整个基因编辑技术发展过程中,各种技术还是有着特定的局限,除了高特异性锌指核酸酶的筛选复杂、TALENs的组装繁琐及CRISPR/Cas9对基因组PAM序列的高度依赖外,以上三种技术在基因组编辑效率方面始终存在着重重阻碍。基于该问题,本实验室从2011年以来就一直致力于开发用于酵母和哺乳动物细胞水平核酸酶活性鉴定及提高基因组水平编辑效率的报告系统,为准确衡量及评估核酸酶活性、提高核酸酶基因组编辑效率提供了多个选择。本研究中在酵母水平及哺乳动物细胞水平都开发出了高灵敏度的核酸酶活性验证系统。首先在酵母细胞中构建了基于Gal4 BD和Gal4 AD的单链退火(SSA)报告系统,并系统优化了同源臂长度对SSA修复效率的影响;在哺乳动物细胞水平,通过比较核酸酶产生DNA双链断裂(DSB)后非同源末端连接(NHEJ)和单链退火修复效率的差异,开发出了高效的SSA-RPG核酸酶活性检测及基因组编辑阳性细胞富集系统;同时也比较并优化各个核酸酶平台,为将来挑选高效的核酸酶提供了有益参考。本文的主要研究结果如下:1.建立了基于酵母Gal4 BD-AD的单链退火(SSA)报告系统,当核酸酶切割两条同源臂间的识别序列时会产生双链断裂切口,进而引发SSA重组,从而与转化效率组进行比较而得到核酸酶的切割效率。为了有效降低报告载体自发重组引起的假阳性,构建了同源臂长度从20 bp到164 bp以10 bp递增的15个同源臂长度的一系列报告载体。在单独转化报告载体的情况下,通过在营养缺陷型培养基中计数阳性克隆的数目,发现自发同源重组效率随同源臂长度的增加逐渐提高,且20 bp是报告载体自发重组所需的最短长度;当该报告载体与ZFNs同时转化到酵母中时,DSBs介导的同源重组效率也随着同源臂长度的增加而不断提高,且30 bp长度的同源臂可以引起高效率的同源重组,用来快速衡量核酸酶在酵母水平的切割活性。2.构建了哺乳动物细胞水平的核酸酶活性鉴定及阳性细胞富集系统。通过将药物筛选基因嘌呤霉素(puromycin)和两种荧光素酶基因(DsRed和eGFP)整合运用,构建了DsRed-Puromycin-eGFP(RPG)报告系统,DsRed红色荧光蛋白的表达由独立的启动子控制,用于衡量载体的细胞转染效率,puromycin和eGFP由剪切肽T2A融合在一起表达,通过在puromycin基因前面和中间引入核酸酶识别序列打断开放阅读框,分别构建了基于NHEJ和SSA两种修复机制的报告系统,分别命名为NHEJ-RPG和SSA-RPG报告系统,当核酸酶识别靶向序列并切割后,两种系统分别通过NHEJ和SSA修复后引起puromycin和eGFP基因的表达,进而可以通过细胞流式分选(FACS)和药物筛选来检测核酸酶活性。本研究系统比较了核酸酶切割产生粘性末端和平末端的情况下NHEJ和SSA修复效率的差异,发现当同源臂长度大于等于100 bp时SSA的修复效率要高于NHEJ,且SSA修复的效率在同源臂长度达到200 bp时开始稳定在一定水平并不再显著提高;且筛选后的细胞中基因组被编辑的效率与未筛选组相比提高6.3到34.8倍。3.为了提高核酸酶的活性,本研究通过位点特异性突变的方法构建了突变型FokI,通过与锌指蛋白融合保证了ZFNs的高活性并降低脱靶效率。综上所述,本研究在酵母和哺乳动物细胞水平都优化构建了一套简洁高效的核酸酶活性验证系统,且该系统可用于筛选富集基因组编辑阳性细胞,为将来基因组编辑技术的广泛应用鉴定了坚实基础,进而为使用靶向核酸酶技术对动物进行遗传改造及育种研究奠定基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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