海洋细菌来源的功能蛋白对海洋中重要有机物的识别及催化机制

发布时间：2017-12-23 23:24

  本文关键词：海洋细菌来源的功能蛋白对海洋中重要有机物的识别及催化机制　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：微生物在海洋氮循环和海洋硫循环中发挥着重要作用。肽类物质的摄取是海洋微生物摄取营养物质过程的重要组成部分。海洋细菌对肽类物质的摄取也是海洋氮循环过程的重要一环。三甲胺(TMA)和氧化三甲胺(TMAO)是海洋细菌的重要氮源。细菌在胞内利用TMA单加氧酶将TMA氧化为IMAO。海洋中二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)的产量非常大,全球每年约有109吨的DMSP产生。海洋细菌利用胞内的DMSP裂解酶裂解DMSP产生二甲基硫(DMS)。DMS是全球硫循环的重要参与者,DMS的氧化产物可以影响全球气候。在本论文中,我们主要对海洋氮循环和硫循环中重要生理过程的分子机制进行研究,包括研究海洋细菌对二肽的识别机制、对TMAO的识别机制、氧化TMA生成TMAO的分子机制、以及裂解DMSP生成DMS的分子机制。一、海洋细菌对二肽的多重特异性识别机制研究肽类物质的摄取是海洋细菌的一个重要生理过程,也是海洋氮循环过程的重要一环。然而,海洋细菌摄取肽类物质的分子机制尚不是十分清楚。二肽转运系统(Dpp)是细菌中一个重要的转运肽类物质的ABC型转运系统,主要负责二肽的转运。DppA是Dpp转运系统中位于周质空间的底物结合蛋白,DppA的底物特异性决定了Dpp的底物特异性。在本论文研究中,我们用等温滴定量热仪分析了来源自深海细菌Pseudoalteromonas sp. SM9913的DppA (PsDppA)对25种不同二肽的底物特异性。PsDppA对其中的8种二肽展现出高亲和力。为了阐明PsDppA的多重特异性底物识别机制,我们解析了不结合底物的PsDppA的晶体结构和结合有4种不同底物(Ala-Phe、Met-Leu、Gly-Glu和Val-Thr)的PsDppA复合物的晶体结构。在底物结合前后,PsDppA会由“开放”状态转变为“闭合”状态。对4种PsDppA与底物复合物的晶体结构分析和突变分析表明,PsDppA在结合底物时采用十分精确的机制：PsDppA主要依靠其氨基酸残基与二肽底物主链的相互作用结合二肽分子,尤其是PsDppA与二肽底物间的盐桥相互作用；疏水相互作用在PsDppA结合疏水性较强的二肽时起到重要作用；氨基酸残基Lys457对PsDppA结合C末端氨基酸为谷氨酸或谷氨酰胺的二肽时发挥关键作用。序列比对表明,革兰氏阴性细菌的二肽底物识别机制与PsDppA的底物识别机制是相似的。总的来说,我们的研究结果为海洋革兰氏阴性细菌多重特异性二肽底物识别机制提供了结构基础,有助于我们更好地理解海洋细菌摄取肽类物质的生理过程。二、海洋细菌对TMAO的识别机制研究TMAO是海洋细菌的一种重要的氮源。海洋中的TMAO能被海洋细菌代谢为挥发性的甲基胺类物质,这些挥发性的甲基胺类物质是温室效应气体一氧化二氮的前体物质。然而,微生物识别和转运TMAO的分子机制到目前为止并不清楚。海洋玫瑰杆菌属细菌Ruegeria pomeroyi DSS-3中有一个特异性转运TMAO的ABC型转运系统：TmoXWV。TmoX是TmoXWV转运系统中位于周质空间的底物结合蛋白。在本论文研究中,我们分析了TmoX的底物特异性,重组表达的TmoX在体外展现出对TMAO很强的亲和力。我们进一步解析了TmoX/TMAO复合物的晶体结构。通过生化分析、结构分析和突变分析,我们揭示了TmoX结合TMAO的分子机制。TmoX的晶体结构中含有一个Ca2+,生化分析表明这个Ca2+在维持TmoX蛋白稳定性方面发挥着重要作用。分子动力学模拟实验表明,在底物结合前后,TmoX会由“开放”状态转变为“闭合”状态。在TmoX的底物结合腔中,四个色氨酸残基的吲哚环与TMAO分子形成cation-π相互作用,氨基酸残基Glu131与TMAO的极性氧原子形成一个氢键。除此之外,TmoX底物结合腔中苯丙氨酸的侧链与色氨酸侧链之间形成的π-π堆积相互作用也对TmoX结合TMAO是必需的。序列分析表明海洋细菌,尤其是海洋玫瑰杆菌属的细菌,识别TMAO的机制与本论文中提出的TmoX识别TMAO的分子机制是相似的。我们的结果有助于更好地理解海洋细菌摄取TMAO的生理过程。三、海洋细菌氧化TMA生成TMAO的分子机制研究TMA和TMAO在海洋中广泛存在,它们都是海洋细菌的重要氮源物质。细菌中的黄素单加氧酶(FMO)被称为Tmm,Tmm能够氧化TMA生成TMAO。编码Tmm的基因在海洋细菌中丰度很高。Tmm在海洋碳循环和氮循环中发挥着重要作用。然而,Tmm氧化TMA的分子机制尚不清楚。在本论文研究中,我们测定了来源白海洋细菌Roseovarius nubinhibens ISM的Tmm的基本酶学性质,其最适酶活温度为30℃,最适酶活pH为8.0。进一步,我们解析了Tmm/FAD/NADPH复合物的晶体结构、失活突变体Tyr207Ser/FAD/NADPH复合物的晶体结构和高浓度TMA浸泡处理的Tyr207Ser/FAD/NADPH复合物的晶体结构。Tmm的催化过程可以分为两个半反应：还原半反应和氧化半反应。结构分析显示在氧化半反应中,Tmm结构中的NADP+分子能够产生构象变化,与Tmm的氨基酸残基Asp317形成一个新的氢键,NADP+的这种构象变化导致了两个结果：一是关闭底物进入通道,为催化反应创造一个受保护的微环境；二是将Tmm被激活的催化中心暴露给TMA,完成催化反应。这是NADP+分子在催化反应的整个过程中始终结合在Tmm上的第一个结构证据。结合实验结果,我们提出了Tmm催化TMA产生TMAO的分子机制。序列分析表明我们提出的Tmm的催化机制在细菌中是普遍存在的,尤其是在海洋玫瑰杆菌属和SAR1l类群的细菌中。我们的结果进一步阐明了FMO类蛋白的催化机制,也有助于更好地理解海洋细菌参与的海洋碳循环和氮循环机制。四、海洋细菌裂解DMSP生成DMS的分子机制研究微生物通过DMSP裂解酶裂解DMSP产生挥发性的DMS,该反应在全球硫循环和碳循环中发挥着重要的作用。DMS在从海洋挥发到大气中后,会被氧化,其氧化产物能参与云凝结核的形成,进而可能影响全球的气候。目前,有6种来源于不同微生物的DMSP裂解酶的基因得到鉴定,但这些酶催化DMSP裂解的分子机制尚不清楚。DMSP裂解酶DddQ的编码基因是在海洋宏基因组数据库中含量最多的DMSP裂解酶基因之一。在本论文中,我们探究了细菌Ruegeria lacuscaerulensis ITI_1157中一种DMSP裂解酶(DddQ)裂解DMSP的分子机制。我们首先检测了DddQ的基本酶学性质,DddQ的最适酶活温度为30℃,最适酶活pH为8.0。Mn2+和Co2+对DddQ的酶活有显著的促进作用,而Zn2+则几乎完全抑制了DddQ的酶活。随后,我们解析了DddQ结合抑制剂的晶体结构以及DddQ的失活突变体TyrB1Ala结合DMSP的晶体结构。结构分析表明,DddQ采用p桶式折叠方式,其活性中心螯合一个Zn2+,并有六个高度保守的氨基酸残基(Tyr120、His123、His125、Glu129、Tyr131和His163)。突变体的生化实验分析显示这些氨基酸残基是催化所必需的。值得注意的是,氨基酸残基Tyr131在催化过程中作为催化碱,通过构象变化发动亲核攻击,引发DMSP裂解反应这个典型的p消除反应。结构分析和分子动力学模拟显示,在DddQ的底物结合腔上方,有两个柔性较强的卷曲能在“开放”和“关闭’状态间转换,对DMSP的进入起到门控作用。综合实验结果,我们提出了DddQ催化DMSP裂解产生DMS的分子机制。本研究首次揭示了DMSP裂解为DMS的分子机制,有助于我们更好地理解这个重要的生物地球化学反应。总而言之,本论文研究了在海洋有机氮和有机硫循环中几个重要生理过程的生物化学机制,有助于我们更好地理解海洋氮循环和硫循环的过程。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936
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本文编号：1325942