低强度激光（LLL）对间充质干细胞（MSCs）的生物学效应研究

发布时间：2017-12-24 09:29

  本文关键词：低强度激光（LLL）对间充质干细胞（MSCs）的生物学效应研究　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 间充质干细胞 低水平激光 增殖 线粒体 迁移 凋亡 免疫调节

【摘要】：光生物调节(PBM)通过光线影响内源光感受器的活性,激活线粒体逆行信号传导途径改变细胞增殖和代谢。低水平激光(LLL)是用于光生物调节的常见光源。光谱中这个区域中的光可以穿透组织且不具有致癌性质。低水平激光(LLL)已作为非侵入性物理治疗应用于临床,例如骨质疏松症,通过改变骨髓间充质干细胞的状态来发挥作用。由于光疗法广泛用于医学,干细胞疗法和光疗法的组合似乎是一个更加明智的选择。LLL对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的效应机制仍有待研究。一种可能的机制是线粒体呼吸链中的细胞色素C氧化酶参与光子吸收。微阵列技术发现辐照后涉及能量产生和细胞抗氧化保护途径的基因表达显着上调。在本文的第一部分,我们评估了LLL对细胞活力,迁移,抗凋亡能力的影响以及探讨了相关机制。使用MTS测量细胞增殖,并通过流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期。通过TEM、FCM、QRT-PCR和免疫荧光评价LLL对线粒体生物发生(分裂和融合)和功能(ATP,ROS,NO)的影响。使用transwell、免疫荧光、ELISA和Westernblot评估细胞迁移和细胞骨架改变(肌动蛋白和微管蛋白)。使用流式细胞术、免疫荧光和Westernblot评估细胞凋亡。我们研究了低水平激光(LLL)LLL照射1小时后继续培养6小时或24小时后MSCs上述各项指标的变化。作用机制包括增殖速率增加介导的S期比例上调;通过融合(Mfn1,Mfn2和Opa-1)和分裂(Fis1,Drp-1和MTP18)相关蛋白介导的线粒体生物发生,以及NRF1,TFAM,PGC-1a表达上调和细胞内ROS和NO浓度变化介导的线粒体功能改变;通过ERK1/2和FAK途径以及生长因子如HGF和PDGF的上调引起细胞迁移加速;通过增加Bcl-2和降低Bax蛋白表达量,或者LLL处理的MSC与5-氟尿嘧啶诱导凋亡的MSC之间形成隧道纳米管(TNT)来抵抗凋亡。MSCs在动物模型和临床上获得了良好治疗效果,对于MSCs和基于它的产品在再生医学中的应用将会被持续探讨。MSCs促进组织救援/治疗的机制包括:(1)涉及到蛋白/多肽以及激素分泌的旁分泌作用;(2)通过隧道纳米管或者微囊泡转移线粒体;(3)通过外泌体exosomes转移RNA等分子。MSC被募集到应激或炎症部位以实现其修复功能。MSCs的免疫调节不是自发的,需要“授权”或激活来发挥其免疫抑制作用。MSCs表面表达Toll样受体(TLR),TLR信号传导参与MSCs的许可。MSC表面表达的TLR3和TLR4可分别被双链RNA如polyl:C和脂多糖LPS所激活。活化TLR4信号后MSCs会释放增强炎症反应的细胞因子(IL-6,IL-8和TGF-b等)从而极化成MSC1型促炎细胞,MSC1型细胞能活化T细胞;相反,激活TLR3信号后,MSCs会产生抑制炎症反应的细胞因子(IDO,PGE-2,IL-4和IL-1RA)极化成MSC2抑炎细胞,MSC2型细胞具有抑制淋巴细胞增殖的能力。在本文的第二部分,我们探讨了 LLL对TLR4诱导因子LPS介导的MSCs炎症反应的抑制作用。通过ELISA试剂盒和QRT-PCR评价炎性因子表达和分泌,用CM-H2DCFDA和DAF-FM试剂盒测量细胞内ROS和NO含量变化,发现LLL降低LPS诱导MSC中IL-1β,IL-6,IL-8,ROS和NO的分泌。免疫荧光检测NF-κ B在LLL照射的MSC中核易位相对于LPS诱导组显著下降。Western blot分析表明,LLL通过调节p65和Iκ Bα的磷酸化抑制NF-κ B的活化。我们将纯化的外周血单核细胞(PBMC)通过植物凝集素(PHA)刺激后与3种方式处理的MSCs共培养发现,LLL处理后的MSC显着降低淋巴细胞激活标记CD25和CD69在PHA刺激的淋巴细胞上的表达。综上所述,我们使用11-16 J/cm2剂量的LLL促进MSCs的增殖,迁移和抗凋亡能力以及加强其抑炎作用。LLL可以作为MSC在移植前预处理手段,以达到基于干细胞治疗的安全和长期功效。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R329.2

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本文编号：1327838