Orexin神经肽和去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元活动调控的研究

发布时间：2017-12-24 12:34

本文关键词：Orexin神经肽和去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元活动调控的研究　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：运动是在神经系统中多种运动相关神经元精密协同下完成的一项重要生理功能。其中,脑桥尾侧网状核(caudal pontine reticular nucleus,PnC)的网状脊髓神经元(reticulospinal neurons)作为重要的“桥梁”,广泛转接来自皮层、中脑、脑干和小脑的不同运动信息并直接调控脊髓运动神经环路活动,在中枢多种运动行为中均发挥重要作用。既往研究表明,损毁Pn C会导致躯体姿势及肌张力调节异常,说明Pn C可能是中枢介导姿势及肌张力调节的重要脑区。姿势及肌张力调节受到多种生理功能状态的影响。很有意思的是,通过睡眠剥夺影响受试者觉醒状态会对其姿势及肌张力的正常维持造成显著损害,表明躯体姿势及肌张力正常调节依赖于良好的觉醒状态。业已证实,机体觉醒状态的启动及维持依赖于皮层下多种促觉醒系统的活动。不同觉醒系统间相互联系形成复杂网络,由该网络发出的觉醒纤维广泛支配了整个神经系统。其中,运动脑区同样受到觉醒纤维的支配,表明代表觉醒信息的觉醒递质可以直接调控运动脑区活动,并参与中枢运动行为执行。值得注意的是,下丘脑orexin系统的缺陷可以直接导致猝倒(cataplexy)这一机体躯体姿势及肌张力调节障碍的疾病,且LC-NA能系统在猝倒发作时突然停止活动,表明下丘脑orexin能系统和LC-NA能系统在正常觉醒状态下姿势及肌张力的调节中存在重要作用。已有研究表明,下丘脑orexin能系统和脑干LC-NA能系统可以通过不同机制调控中枢(包括脊髓、外侧前庭核和小脑等)姿势及肌张力调节相关脑区的活动,并参与觉醒状态下正常姿势及肌张力的调节。既然如此,PnC作为中枢姿势及肌张力调节的重要脑区是否也受到下丘脑orexin能系统和脑干LC-NA能系统的调控成为本文的主要关注点。以往的形态学研究表明,orexin能以及NA能纤维均在Pn C中有丰富的分布,然而该投射的功能目前尚不明确。因此在相关部分实验中,我们首先采用western blot以及免疫组织化学技术对Pn C脑区中orexin以及NA能受体的分布进行了检测。在此基础上进一步采用膜片钳结合神经药理学方法观测比较了orexin和NA对Pn C网状脊髓神经元全细胞电流活动的影响并分别揭示了其机制。有意思的是,orexin和NA均能通过直接的突触后机制调控Pn C网状脊髓神经元的活动,表明PnC可能是orexin和na参与运动功能调控的重要脑区。在上述基础上,本文首先围绕下丘脑orexin能系统,对其在pnc中的作用进行了系统的研究。我们进一步观测了orexin对pnc网状脊髓神经元突触传递,包括微小兴奋性突触后电流(miniatureexcitatorypost-synapticcurrent,mepsc)和微小抑制性突触后电流(miniatureinhibitorypost-synapticcurrent,mipsc)的影响及机制。在明确orexin对pnc网状脊髓神经元的突触前及突触后调控效应及机制的基础上,我们进一步结合神经药理学和行为学技术解答了orexin突触前/后的不同调控效应如何分别参与了对pnc网状脊髓神经元所介导的声音震惊反射(acousticstartleresponse,asr)这一姿势控制行为的调控。本文主要研究结果总结如下:1.orexin和na能受体在pnc中的分布。orexin及na能纤维分布于pnc中,但其受体表达情况尚不清楚。本文首先采用免疫组织化学及westernblot方法,分别对其受体在pnc中的表达进行了检测。orexin-2型受体已被证明存在于pnc中。利用免疫荧光技术检测发现,orexin-1型受体同样在pnc中存在丰富表达。我们接下来应用westernblot技术对na能受体的不同亚型在pnc中的分布进行检测。westernblot结果表明,na能不同受体亚型,包括α1a、α1b、α1d、α2a、α2b和α2c受体,在pnc中均有表达。应用免疫酶标的方法,本研究同时对na能受体在pnc神经元中的分布进行了检测。同样,上述不同na能受体亚型均表达于pnc网状脊髓神经元中。以上实验结果表明,orexin和na能受体均表达于pnc中,提示orexin和na可以通过作用于这些受体调控pnc神经元活动。2.orexin和na对pnc网状脊髓神经元全细胞电流活动的影响。接下来,通过全细胞膜片钳技术并结合神经药理学手段,我们在根据形态(胞体长轴直径大于35μm)和电生理鉴定的pnc网状脊髓神经元中直接观测比较了orexin和na对其全细胞电流活动的影响。(1)orexin在pnc网状脊髓神经元中诱发内向电流反应。在所有测试的107例pnc网状脊髓神经元中,acsf灌流orexin-a(30-300nm)均诱导出稳定的内向电流反应。此外orexin在pnc网状脊髓神经元中所诱发的内向电流反应存在明显的剂量依赖效应:30、100和300nm的orexin-a所诱发的内向电流反应幅度分别为29.8±9.1pa(n=4)、39.8±4.5pa(n=11)和50.6±5.8pa(n=11)。该部分结果表明,orexin对pnc网状脊髓神经元的活动存在的兴奋性调节作用。(2)na在一部分pnc网状脊髓神经元诱发内向电流反应,在另一部分却诱发外向电流反应。采用同样的方法,我们观察了na对pnc网状脊髓神经元全细胞电流的调控效应。有趣的是,与orexin的作用模式不同,na(3μm)在一部分(33/51例,64.7%)测试的神经元中诱导出内向电流反应,而在剩下的(18/51例,35.3%)神经元中则诱导出外向电流反应。同时,na所诱导的内向和外向电流反应在(1-10μm)测试浓度范围内均呈现出稳定的剂量依赖效应。在9例对na表现出内向反应的pnc网状脊髓神经元中,1、3和10μmna诱发的内向电流反应幅度分别为-20.8±3.8pa(n=8)、-34.9±6.2pa(n=9)和-46.5±7.3pa(n=7)。而在另外9例对na表现出外向反应的pnc网状脊髓神经元中,1、3和10μmna引起的外向电流反应幅度分别为21.3±6.4pa(n=8)、30.9±6.8pa(n=9)和34.3±6.7pa(n=9)。上述结果表明,orexin和na均能调节pnc网状脊髓神经元的全细胞电流活动。然而,与orexin的一致兴奋性调节模式不同,na对pnc网状脊髓神经元活动的调控更为复杂,包括兴奋和抑制两种形式。3.orexin和na通过突触后机制,调控pnc网状脊髓神经元全细胞电流活动。(1)orexin通过激活突触后orexin-1型和orexin-2型受体,在pnc网状脊髓神经元诱导出内向电流。acsf中加入ttx(1μm)对orexin所诱发的内向电流反应的幅度并无显著影响(n=6,p=0.995),说明该效应主要由突触后机制所介导。acsf中加入orexin-1型受体特异性阻断剂sb334867(10μm)仅部分阻断了orexin-a(100nm)所诱发的内向电流反应(n=4,p0.01)。而在acsf中加入orexin-1型及orexin-2型受体的联合阻断剂tcs1102(1μm)则可完全阻断orexin-a(100nm)所诱发的内向电流反应(n=6,p0.01)。上述结果共同表明,orexin通过激活突触后orexin-1及orexin-2型受体,对pnc网状脊髓神经元进行兴奋性调控。(2)非选择性阳离子通道(non-selectivecationchannels,nsccs)的开放介导了orexin对pnc网状脊髓神经元的突触后效应。中枢神经系统中与orexin受体活化相偶联的离子通道包括k+通道、na+-ca2+交换体以及nsccs三种。我们首先在加入orexin-a(100nm)前后,对记录的pnc网状脊髓神经元进行缓慢的斜坡电压(slowramp)刺激(范围:-125~-55mv,斜率:+10mv/s),并得到其分别对应的全细胞电流的i-v曲线关系。在8例测试的神经元中,对照与加入orexin-a后的全细胞电流均未出现交点,在5/8例神经元中,orexin-a与对照组的全细胞电流呈现出平行状态;在剩下的3/8例神经元中,两者则随着刺激电压的增大而呈现出在大于-55mv方向的相交趋势。考虑到在我们实验条件下应用能斯特方程(nernstequation)计算所得的k+平衡电位为-102.3mv,因此k+通道可能并非介导orexin-a所诱发内向电流的主要成分。进一步扩大斜坡电压刺激范围(范围:-125~+5mv,斜率:+10mv/s)后,我们发现在绝大多数(9/10例)测试的神经元中,orexin-a所诱发净电流的平衡电位水平位于-27.2±2.7mv(n=9),接近于nsccs电导的平衡电位水平。在仅有一例测试的神经元中,该电流平衡电位为-99.7mv。该结果表明,在绝大多数pnc网状脊髓神经元中,orexin-a所诱发的内向电流反应由下游nsccs的开放所介导,而k+通道可能仅在极少数pnc网状脊髓神经元上参与了orexin-a所诱发的内向电流反应,并非主要成分。考虑到nsccs开放通透na+和k+,我们进一步采用离子置换实验对上述推论进行了验证。acsf中na+浓度从152.25mm降低至27mm后,orexin-a(100nm)在pnc网状脊髓神经元中所引起的内向电流反应幅度显著减小(n=7,p0.01)。进一步在acsf中加入nsccs的阻断剂flufenamicacid(100μm)同样可以显著降低orexin-a(100nm)所引起的内向电流反应幅度(n=5,p0.01),而na+-ca2+交换体阻断剂sn-6对orexin-a(100nm)所诱发的内向电流反应无显著影响(n=4,p=0.746)。上述结果表明,orexin-a在pnc网状脊髓神经元中所诱发的内向电流反应主要由nsccs的开放所介导,而k+通道可能在极少数神经元中参与了这一反应,但并非主要成分。(3)na通过突触后共表达的α1和α2受体,调控pnc网状脊髓神经元全细胞电流活动。在阐明了orexin调控pnc网状脊髓神经元全细胞电流活动的受体及离子通道基础上,我们进一步对na在pnc网状脊髓神经元发挥效应的受体和离子机制进行了研究。由于该部分工作与实验室他人合作共同完成,在此仅详述我本人完成的受体机制部分工作。结合药理学手段我们对na发挥前述效应的受体机制分别进行了研究。在7例对na呈现内向反应的pnc网状脊髓神经元中,α1受体的特异性阻断剂prazosin(pra,0.01μm)部分阻断了na(3μm)所引起的内向电流反应(n=7,p0.05)。该结果表明,突触后α1受体参与了na所诱发的内向电流反应。然而acsf中加入10μmpra后,在完全阻断上述内向电流反应的同时,na在同一神经元中诱发出了稳定的外向电流反应(平均幅度:23.5±5.1pa,n=7)。进一步在acsf中加入α2受体的特异性阻断剂yohimbine(yh,10μm)方可完全阻断na在此神经元上所引起的反应(p0.01)。上述结果表明,na在pnc网状脊髓神经元中所诱发的整体内向电流其实包含有2种成分:一是α1受体激活所产生的内向电流成分;二是α2受体激活所产生的外向电流成分。上述两种成分整合后,表现出na所引起的内向电流反应。在另外6例对na呈现出外向反应的pnc网状脊髓神经元中,yh(0.1μm)部分阻断了na(3μm)所引起的外向电流反应(n=6,p0.01)。该结果表明,突触后α2受体参与了na所诱发的外向电流反应。acsf中加入10μmyh后,在完全阻断上述外向电流反应的同时,na在同一神经元中诱发出了稳定的内向电流反应(平均幅度:-13.7±2.3pa,n=6)。进一步在acsf中加入pra(10μm)方可完全阻断na在此神经元上所引起的反应(p0,01)。上述结果共同表明,α1和α2受体共表达于单个pnc网状脊髓神经元中,其激活可以分别产生内向及外向电流成分,两种成分的不同整合介导了na对pnc网状脊髓神经元兴奋和抑制性调控。与此一致,我们的免疫荧光双标结果表明,α1a和α2a受体亚型的确共表达于单个pnc网状脊髓神经元中。4.orexin对pnc网状脊髓神经元mepsc和mipsc突触传递的影响及机制。在本部分工作中,我们首先以orexin-a系统为中心,进一步探索了其对pnc网状脊髓神经元突触传递影响及机制。通过药理学手段,我们分离出了代表突触前兴奋性信息自发释放的mepsc和代表突触前抑制性信息自发释放的mipsc。(1)orexin抑制pnc网状脊髓神经元mepsc的频率,但对mipsc无显著影响。在测试的9例pnc网状脊髓神经元中,orexin-a(300nm)既不影响mipsc的平均频率(n=9,p=0.469),也不影响其平均幅度(n=9,p=0.653),说明orexin-a对pnc网状脊髓神经元突触前抑制性信息释放并无显著影响。在另外8例神经元中,我们发现orexin-a(300nm)可以显著抑制mepsc的频率(n=8,p0.01),但不影响其幅度(n=8,p=0.501),该结果表明orexin可以通过突触前的机制对pnc网状脊髓神经元突触前兴奋性信息释放进行抑制性调控。(2)orexin通过动员内源性大麻素系统,抑制pnc网状脊髓神经元mepsc的频率。在acsf中加入大麻素1型受体(canabinoidtype1receptor,cb1r)的特异性阻断剂am251(1μm)后,上述orexin-a(300nm)对mepsc频率的抑制效应被完全阻断(n=8,p=0.521),而mepsc的幅度仍然不受影响(n=8,p=0.114)。综上,该部分结果证明orexin可以通过动员内源性大麻素系统,通过激活突触前谷氨酸末梢cb1受体,对pnc网状脊髓神经元谷氨酸的释放进行抑制性调控。与电生理实验结果相一致,我们的免疫荧光结果表明内源性大麻素合成限速酶diacylglycerollipaseα(daglα)在pnc网状脊髓神经元中均存在丰富的表达。5.orexin的突触前抑制效应参与了对crn功能性传入(crn-eepscs)的抑制。在上述阐明orexin抑制pnc网状脊髓神经元mepsc的基础上,我们进一步想知道该突触前效应是否在功能活动层次参与了对pnc网状脊髓神经元所接收到的功能性兴奋传入的调控。通过电刺激crn,我们在pnc网状脊髓神经元中记录到了crn-eepscs。在acsf中灌流orexin-a(300nm)显著抑制了刺激所诱发的eepsc1的幅度(n=10,p0.01)。并且该抑制效应同时伴随着eepsc2/eepsc1比值的增大(n=10,p0.01),提示orexin-a可以通过突触前的机制对crn兴奋性信息的传入进行抑制性调控。进一步在acsf中加入am251(1μm)后,上述orexin-a对eepsc1幅度的抑制效应几乎被完全阻断了(n=6,p=0.203),同时eepsc2/eepsc1比值也不在发生变化(n=6,p=0.841)。综上所述,该部分结果说明,上述orexin对pnc网状脊髓神经元mepsc的抑制效应同样在功能层次参与了对功能性兴奋传入的抑制性调控6.orexin对pnc网状脊髓神经元的突触后及突触前调控效应在行为水平参与了对asr姿势控制行为的调节。在上述研究发现基础上,我们进一步在行为水平观察了orexin对pnc网状脊髓神经元介导的asr行为的影响。结果表明,pnc脑区双侧微量注射30μmorexin-a在不同声音刺激强度(94-112db)下均显著增大了asr反应幅度。这与orexin-a对pnc网状脊髓神经元突触后的兴奋效应相一致。但pnc脑区双侧微量注射3μmorexin-a在较小的94db声音刺激时却显著抑制了asr反应幅度(p0.01,n=13)。有意思的是,在注射3μmorexin-a的同时注射am251(1mm)阻断orexin-a对pnc网状脊髓神经元的突触前抑制效应后,3μmorexin-a在94db时对asr发生幅度的抑制效应被完全阻断。该结果表明,在orexin-a浓度较低且外界传入声音强度较弱时,orexin-a对突触前兴奋信息传入的抑制效应大于对突触后的兴奋效应,使得其整合后在行为水平表现为抑制asr反应。与此相一致,我们进一步发现30μmorexin-a对于asr的阈值并无显著影响(n=9,p=0.347);但3μmorexin-a却显著增加了asr发生的阈值(n=9,p=0.347)。该部分结果不仅表明orexin-a对pnc网状脊髓神经元的突触前、后调节效应分别参与了对其幅度和阈值的调控,同时也提示在不同生理情况下,这两者在神经元活动及行为层次的整合可以促进pnc网状脊髓神经元对较强刺激做出快速有效反应,并同时过滤噪声传入信息的影响,进而促进相应运动行为的高效准确执行。综上所述,本文揭示了orexin和na均可通过直接的突触后效应对pnc网状脊髓神经元活动进行调控。其中,orexin通过激活突触后orexin-1及orexin-2受体,并开放nsccs对pnc网状脊髓神经元进行兴奋性调控。而与orexin不同,na通过激活共表达与pnc网状脊髓神经元突触后的α1和α2受体,对pnc网状脊髓神经元可以进行兴奋或抑制性的双向调控。在此基础上,我们首先系统解答了orexin在pnc中作用的生理意义。Orexin不仅通过突触后机制对PnC网状脊髓神经元进行兴奋性调控,同时通过动员内源性大麻素系统对其突触前兴奋信息的传递进行抑制性调控。该突触前/后调控效应均在行为层次参与了对ASR行为的调节。通过上述实验,我们系统揭示了orexin通过调控Pn C网状脊髓神经元活动,可以促进机体对较强刺激做出快速有效反应,并同时过滤噪声传入信息的影响,进而促进相应运动行为的高效准确执行。本文研究为中枢觉醒系统参与运动提供了新的中枢神经机制,并为理解与觉醒系统异常相关运动疾病的发病机制提供了新的研究方向。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338

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