Tudor-SN蛋白参与细胞周期及细胞增殖调控的机制研究
本文关键词：Tudor-SN蛋白参与细胞周期及细胞增殖调控的机制研究 出处：《天津医科大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：研究目的:细胞周期,是一个细胞从上一次分裂发生,到下一次分裂形成两个子细胞的过程,它是生命不断延续并更新的基础。细胞通过每个周期的完成,来实现遗传物质的复制以及平均分配。细胞周期与细胞增殖、细胞分化之间存在着密切的联系,它们彼此协调,互相控制,共同在多种疾病(尤其是肿瘤)中发挥重要作用。细胞周期的调控涉及细胞周期蛋白(cyclins)的时序性表达和降解、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdks)和Cdk抑制蛋白(Cdk Is)活性的改变、以及一些相关转录因子的调控等。Tudor-SN蛋白是一个在多种动、植物细胞和组织中广泛表达的保守的多功能蛋白,近些年不断有研究发现Tudor-SN蛋白参与各种肿瘤的发生发展。本课题组前期研究发现,Tudor-SN蛋白可以促进He La细胞G1期至S期的周期进程;并且当细胞同步化于G1末期,再向S期释放时,Tudor-SN蛋白的敲低可以阻止细胞向S期的释放。可见,Tudor-SN蛋白是一个新发现的参与细胞周期调控的调节因子。但关于Tudor-SN蛋白调控细胞周期进程的详细信号通路尚未揭示。课题组的相关研究还显示,敲低Tudor-SN蛋白的表达可以抑制细胞的增殖活力,并且Tudor-SN蛋白的表达水平与细胞的增殖能力密切相关:在增殖能力旺盛的细胞中表达水平高,在终末分化退出增殖周期的细胞中低表达或不表达,但调控的原因并不清楚。本课题为解决以上两个问题,将分为两部分展开研究,第一部分旨在研究Tudor-SN蛋白调控细胞周期G1期至S期进程的具体机制;第二部分将探讨不同增殖能力的细胞或组织中Tudor-SN蛋白差异表达的调控机制。希望通过两部分的研究,完善Tudor-SN蛋白参与细胞周期及细胞增殖调控的上游及下游信号通路,并为研究Tudor-SN蛋白通过调控细胞周期参与细胞的增殖、分化以及肿瘤的发生发展提供新的思路。研究方法:本课题的研究主要分为两个部分。第一部分研究旨在明确Tudor-SN蛋白参与细胞周期G1期至S期周期进程调控的具体机制:1)利用免疫共沉淀(Co IP)技术结合细胞同步化技术明确不同周期时相Tudor-SN蛋白的表达水平及磷酸化修饰情况;2)利用Co IP及激酶活性抑制等方法明确不同周期时相磷酸化Tudor-SN蛋白的上游蛋白激酶;3)利用生物信息学预测、点突变技术、流式细胞周期检测、双荧光素酶分析技术等明确Tudor-SN蛋白参与细胞周期调控的磷酸化修饰位点;4)利用双荧光素酶活性分析技术、WB及PCR实验验证Tudor-SN蛋白对S期基因转录水平的调控作用;5)利用Co IP、染色质免疫共沉淀(Ch IP)等方法明确Tudor-SN蛋白调控S期基因表达的具体方式。第二部分探讨不同增殖能力的细胞或组织中Tudor-SN蛋白差异表达的调控机制研究:1)利用WB、Realtime PCR、蔗糖密度梯度离心、多聚核糖体分布分析等检测Tudor-SN蛋白在终末分化心肌细胞中低表达的调控机制;2)通过DBTSS数据库明确Tudor-SN m RNA的转录起始位点,并分析其是否具有5’TOP序列;3)利用双荧光素酶实验结合抑制剂的使用明确PI3K/AKT/m TOR信号通路在肿瘤细胞系(He La)及心肌细胞系(H9C2)中对Tudor-SN蛋白及m RNA表达水平的调控;4)通过KEGG公共数据库对前期心肌组织芯片的差异基因进行Pathway分析,筛选出与PI3K/AKT/m TOR信号传导通路关系密切的基因,并利用Realtime PCR在出生1天及成年小鼠心肌组织中对芯片结果进行验证;5)利用流式细胞周期检测分析Tudor-SN蛋白对PI3K/AKT/m TOR信号通路调控细胞周期的影响。结果:1、Tudor-SN蛋白在不同细胞周期时相的丝/苏氨酸磷酸化修饰水平不同,G1/S期及G2/M期Tudor-SN蛋白的丝/苏氨酸磷酸化修饰水平高于其他期;而Cdk激酶是磷酸化Tudor-SN蛋白的上游激酶;Ser 426/Thr 429位点是Tudor-SN蛋白参与细胞周期调控的关键磷酸化位点;Tudor-SN蛋白通过募集组蛋白乙酰化酶(GCN5)至E2F-1转录复合体,增强E2F-1与下游基因(cyclin A,E2F-1)启动子的结合能力,促进S期基因的转录活性,进而促成细胞G1/S期的转换。2、Tudor-SN在退出细胞周期的终末分化心肌细胞中仅蛋白低表达,m RNA表达并未降低,调控发生在翻译水平;Tudor-SN m RNA含有5’TOP序列,并且其5’TOP序列对基因表达的调控受PI3K/AKT/m TOR信号通路影响;Tudor-SN蛋白的表达受PI3K/AKT/m TOR/4EBP信号通路的调控;成熟小鼠心肌组织中PI3K/AKT/m TOR信号通路处于低活性状态;Tudor-SN蛋白影响PI3K/AKT/m TOR信号通路对细胞周期的调控。结论:1、Tudor-SN蛋白通过增强E2F-1下游基因的转录表达,促进细胞完成G1/S周期的转换,在这个过程中,Cdk类激酶是Tudor-SN蛋白的上游激酶,Ser426/Thr 429是其参与周期调控的关键磷酸化位点。2、Tudor-SN是一个新发现的TOP m RNA,其在心肌细胞及肿瘤细胞中的表达水平受PI3K/AKT/m TOR/4EBP信号通路调控,同时作为PI3K/AKT/m TOR信号传导通路的下游效应分子,Tudor-SN蛋白影响PI3K/AKT/m TOR信号传导通路对细胞周期的调控。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
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3 $$点评人：陆佳韵（现为中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点试验室博士生） $$吴eㄖ泄窖Э蒲г褐琢鲅芯克赴锸抑魅危夜窖б糯У牡旎酥唬，
本文编号：1329506
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