云南省埃及伊蚊种群遗传特征研究

发布时间：2017-12-25 05:08

本文关键词：云南省埃及伊蚊种群遗传特征研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：登革热是由登革病毒引起的一种重要虫媒传染病,近年来,全球登革热发病率急剧上升,有100多个国家呈地方性流行,其中东南亚是受侵袭最严重的地区之一。云南省在历史记载中有过少量登革热输入病例的报道,但自从2008年开始出现本地感染病例以后,尤其是2013年以来云南省已经多次发生由输入病例引起的本地感染登革热疫情暴发。埃及伊蚊是重要的医学昆虫,是登革热的主要传播媒介。埃及伊蚊起源于非洲,主要分布在热带和亚热带地区。虽然其飞行扩散距离有限,但可以通过成蚊、蛹、幼虫、卵等方式随着飞机、轮船、汽车运输或其他人类活动而发生远距离的被动扩散,在19世纪后期通过航运入侵到东南亚。2000年以前,埃及伊蚊在我国的分布也仅限于北纬22°以南地区,包括台湾南部、海南以及广东、广西的部分地区和个别岛屿,在云南省并未有过埃及伊蚊的记载。然而,全球化发展以及全球气候变暖,为媒介生物的扩散提供了更加便利的条件。自2002年2月首次在云南省发现埃及伊蚊以来,现已在瑞丽、芒市、勐腊、勐海、景洪、盈江、陇川、泸水、耿马等地陆续发现,且分布范围和种群数量不断扩大,入侵和扩散形势非常严峻,埃及伊蚊已经成为了云南省的一个重要外来入侵蚊种。而且,与云南省接壤的越南、缅甸和老挝等国家均有埃及伊蚊且登革热频发,埃及伊蚊的入侵则加重了云南省登革热暴发和流行的风险。但是,目前对我国云南省的埃及伊蚊研究大多仅限于分布调查层面上,对于其种群遗传分化及特征、抗药性水平及机制等方面缺乏深入研究。基于以上原因,本研究以云南省埃及伊蚊为研究对象,通过现场采集云南省不同地区的埃及伊蚊自然种群,主要从两个方面予以深入研究。一是提取基因组DNA,综合利用微卫星DNA标记和线粒体DNA基因CO I、ND4、ND5进行种群遗传特征研究,以期了解和掌握云南省埃及伊蚊种群遗传多样性和遗传结构特征,并对其种群结构和入侵事件予以探讨;二是将现场采集的埃及伊蚊进行实验室传代养殖后,通过蚊虫抗药性生物学测定、代谢酶活性以及靶标基因的检测,掌握云南省埃及伊蚊对常用杀虫剂的抗药性水平和抗药性分子特征,为化学杀虫剂防治埃及伊蚊提供科学依据。本研究结果如下:1、微卫星研究结果本研究通过文献查找,筛选获得的9个微卫星位点容易扩增且稳定性好、差异性明显、多态信息含量高(PIC=0.392~0.886)。结果表明所选用的9个微卫星位点能够充分满足本研究的需要,每个种群的样本采集量能够满足研究的样本含量需求。9个微卫星位点从28个埃及伊蚊自然种群中共获得等位基因数114个,平均每个位点获得等位基因数12.67个。从位点角度分析看,每个位点平均在每个种群获得的等位基因在3.46~7.14之间。各种群的基因丰富度在3.34~5.72之间,瑞丽和景洪两地埃及伊蚊的种群基因丰富度较为接近,且均高于2016年在其他边境地区采集的埃及伊蚊种群。云南省埃及伊蚊种群总体上具有较高的遗传多样性,9个微卫星位点的观察杂合度在0.108~0.939之间,平均观察杂合度为0.579;而期望杂合度在0.367~0.760之间,平均期望杂合度为0.592。各种群的观察杂合度在0.401~0.689之间,其中2016年在其他边境地区采集的8个种群观察杂合度高于期望杂合度,瑞丽和景洪地区采集的20个种群均为观察杂合度低于期望杂合度。基因型连锁不平衡分析显示云南28个埃及伊蚊自然种群的9个位点之间的1008对位点中,有166对位点存在着显著的连锁情况(P0.05),其他位点均表现为独立遗传(P0.05)。哈迪温伯格平衡检验显示28个种群中仅有景洪(GLR)、勐海(M1H)2个种群发生了哈温平衡偏离。采用TPM和SMM两种模式检测云南埃及伊蚊种群近期是否经历遗传瓶颈效应,结果显示共有10个自然种群产生了瓶颈效应,其中瑞丽地区采集的10个种群中有6个(MNL、JDL、JGH、JCG、GMG、CXT)种群产生了瓶颈效应,占瑞丽地区种群的60%;2016年在其他边境地区采集的8个自然种群中有4个产生了瓶颈效应,占50%;而景洪地区采集的10个种群均没有产生瓶颈效应。近交系数结果显示2016年在其他边境地区采集的8个种群中有7个种群的近交系数均为负数,表示这7个种群近交程度很低,而其他种群的近交系数为正值,意味着这些种群存在不同程度的近交。成对固定指数(FST)分析显示,各种群间仅有17个成对固定指数(FST)未表现出明显的遗传分化,其余361个成对固定指数(FST)均表现出明显的遗传分化。应用STRUCTRUE软件对各个个体的聚类分析,结合群体内遗传差异数据,结果显示当K=3时,将云南省不同地区的28个埃及伊蚊种群分为3类较为合理,瑞丽地区采集的10个种群、景洪地区采集的10个种群以及2016年在其他边境地区采集8个种群各聚成1类。基于Nei’s标准遗传距离应用UPGMA构建系统发育树与PCoA图谱分析也显示同样的结果。分子方差分析(AMOVA)表明不同组之间存在明显的分化,占14.51%;同一区域内不同种群之间的遗传分化占总的6.01%;来自个体之间的遗传分化最为显著,占77.76%。相关性分析显示地理距离和遗传分化之间呈现正相关(r=0.4948,P0.0001)。综合分析判断,2002年发现的瑞丽入侵和2013年发现的景洪入侵应为不同的入侵事件,而2016年采集的其他边境地区仍然存在着持续的多点入侵。2、线粒体DNA研究结果本研究分析了云南省瑞丽和景洪地区20个不同的埃及伊蚊地理种群的线粒体基因CO I、ND4和ND5的基因多样性指数,结果显示CO I基因A+T的含量为66.9%,共获得381个多态性位点,多态性位点占碱基总数的45.36%(其中包括66个自裔位点和315个简约信息位点),共获得单倍型14种,总群体核苷酸多样性指数为0.02265、单倍型多样性指数为0.5583。ND4基因A+T的含量为70.0%,共获得334个多态性位点,多态性位点占碱基总数的55.76%(其中包括126个自裔位点和191个简约信息位点),共获得单倍型18个,总群体核苷酸多样性指数为0.01860、基因单倍型多样性指数为0.47156。ND5基因A+T的含量为74.6%,共获得369个多态性位点,多态性位点占碱基总数的60.89%(其中包括109个自裔位点和254个简约信息位点),共获得单倍型5种,总群体核苷酸多样性指数为0.07223、单倍型多样性指数为0.5098。由于ND5基因片段的单倍型较少(仅5种),本研究仅利用CO I和ND4对瑞丽和景洪地区的20个埃及伊蚊地理种群进行了遗传分化和遗传结构研究。基于CO I基因的遗传分化结果显示景洪的GGH种群与瑞丽的MNL、BFC、HDH、BNS等4个种群遗传分化不显著,反而与景洪地区的GXS、JBQ、YSC、DMY、GSZ、NKH等5个种群间具有明显的遗传分化。而基于ND4基因的遗传分化结果显示瑞丽的HDH种群与景洪的LJY、JBQ、YSC三个种群间不存在明显的遗传分化,更有意思的是,该种群与瑞丽地区其他9个种群具有明显的遗传分化。说明瑞丽和景洪地区的埃及伊蚊种群间可能存在着相互交流。基于CO I和ND4基因的遗传分化结果均显示,景洪地区各种群间遗传分化水平明显低于瑞丽地区各种群间的遗传分化。这一结果与微卫星研究的结果相似。线粒体CO I和ND4基因单倍型虽然能够被网络图分布格局与NJ进化树分化为2个分支,但结合各单倍型的地理种群分布,无法进行非常清楚地分支。Tajima’S D和Fu’s FS中性检验出现了显著的负值,核苷酸错配分布显示分布曲线均呈单峰结构形式,这些结果都说明这些地区的埃及伊蚊经历了明显的种群扩张。3、抗药性生物学测定结果以实验室养殖的云南埃及伊蚊敏感株为参照,采用敏感基线法对幼虫进行生物学测定,三种杀虫剂的毒力以残杀威最低(LC50=1.02882mg/L,95%CI:0.97708~1.08173 mg/L),其次为敌敌畏(LC50=0.0367 mg/L,95%CI:0.03580~0.03770 mg/L),高效氯氰菊酯毒力最高(LC50=0.00102 mg/L,95%CI:0.00088~0.00118 mg/L)。对2016年在云南省西双版纳傣族自治州和德宏州采集的12个埃及伊蚊自然种群幼虫的生物学测定结果显示,对高效氯氰菊酯的抗性倍数在11.31~41.56之间,而对敌敌畏和残杀威虽然抗性水平略有升高,尚未达到抗性种群的标准。通过敏感基线法获得云南埃及伊蚊敏感株的对三种杀虫剂的成蚊诊断剂量分别为残杀威983.41 mg/L、敌敌畏181.95 mg/L、高效氯氰菊酯1493.37mg/L。以诊断剂量法对各自然种群埃及伊蚊成蚊进行生物学测定,成蚊生物学测定结果也显示只对高效氯氰菊酯产生了抗药性,成蚊生测结果与幼虫生测结果基本一致。4、代谢解毒酶活性检测结果本研究采用WHO推荐的生物化学测定法检测了云南埃及伊蚊各自然种群的代谢解毒酶活性,结果显示:各野外种群在受到残杀威抑制作用后,ACHE活性为未受抑制作用的22.36-31.60%之间,其中仅有J-3和J-5略高于30%;以α-Naphthyl Acetate为底物检测得到敏感株EST(1-N)活性均值为111.1717±34.9588 nmole of 1-naphthol/min/mg protein,而野外种群的EST(1-N)活性均值在41.7940 nmole of 1-naphthol/min/mg protein~198.5297nmole of 1-naphthol/min/mg protein之间;以β-Naphthyl Acetate为底物检测得到敏感株EST(2-N)活性为135.4011±47.3301 nmole of 2-naphthol/min/mg protein,野外种群的EST(2-N)活性在39.7117 nmole of 2-naphthol/min/mg protein~214.0106 nmole of 2-naphthol/min/mg protein之间;敏感株MFO活性为3.08±3.77nmol cytochrome C/mg protein,野外种群的MFO活性在5.43 nmol cytochrome C/mg protein~20.11 nmol cytochrome C/mg protein之间,与敏感株相比,野外种群的MFO活性均高于敏感种群;敏感株GST活性为1.2504±0.3961 nmol of CDNB/min/mg protein,野外种群的GST活性在0.6178 nmol of CDNB/min/mg protein~3.4939 nmol of CDNB/min/mg protein之间。上述结果中仅有MFO在所有野外种群中的酶活性升高,而其他代谢酶在不同种群中的表现不一,这一结果提示云南埃及伊蚊对高效氯氰菊酯的抗药性可能主要与MFO酶活性升高有关。对于酶活性水平与生物学测定之间结果差异的原因有待进一步研究。5、靶标抗性检测结果本研究发现云南埃及伊蚊野外株钠离子通道氨基酸序列第1534位点的氨基酸突变,由F突变为C,相对应的碱基TTC突变为TGC,未发现其他突变位点。相关性分析发现这个点的突变仅与对杀虫剂高效氯氰菊酯抗药性成正相关,未发现与对残杀威和敌敌畏抗药性有关。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R384.1

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