植物蛋白激酶CIPK和CK1A的生物学功能及生化分析

发布时间：2017-12-25 15:07

本文关键词：植物蛋白激酶CIPK和CK1A的生物学功能及生化分析　出处：《湖南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：蛋白激酶催化的靶蛋白磷酸化修饰是植物体内调节信号转导的重要机制。已有大量的研究表明,蛋白磷酸化参与了植物的生长发育、植物的抗逆性以及各种信号转导通路等一系列生命过程。CIPK和CK1是植物中研究得较为广泛的两个蛋白激酶亚家族,其中CIPK在CBL-CIPK系统介导的植物对逆境应答过程中发挥了重要作用。CK1在调控植物开花时间,根的发育、微管调控等方面有重要作用。结合本实验室和合作单位的前期工作基础,本文对植物CIPK和CK1进行了系统的生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR分析了基因表达模式,利用过表达和缺失功能突变体对CIPK和CK1在胁迫信号转导与生长发育调控中的功能进行了系统研究,获得了如下主要研究结果:(1)利用生物信息学方法分析了高粱CIPKs编码基因的核酸和氨基酸序列。基因结构分析表明SbCIPKs可分为含内含子和不含内含子两个亚族,在聚类分析中也分布于两个独立的分支。基因组进化分析表明在含内含子和不含内含子分支中均发现有片段倍增现象,而串联倍增则只出现在不含内含子亚族。SbCIPK的蛋白信息分析表明SbCIPK含有两个保守的功能结构域:N端的蛋白激酶结构域和C端的NAF结构域。激酶区为催化结构域,序列高度保守;NAF结构域为CBL相互作用所需结构域,保守程度相对较低。plant CARE分析表明大部分SbCIPK的启动子区都含有多个胁迫信号响应元件,而RT-PCR结果也表明,SbCIPK的表达水平也受到碱胁迫信号的诱导,表明SbCIPKs可能在抗盐胁迫中发挥作用。(2)本实验室前期报道了At CIPK14在拟南芥盐胁迫应答中的功能,本文选取了其同源蛋白SbCIPK4进行了初步的功能研究。SbCIPK4过表达植株在盐胁迫条件下的表型数据表明,在盐胁迫条件下野生型的幼根的生长及幼苗半径相较于过表达植株都受到了更显著的抑制,同时,胁迫信号通路的关键基因的RT-PCR结果也显示SbCIPK4过量表达转基因植株中胁迫反应相关基因的表达受盐诱导的程度大,说明盐胁迫条件下SbCIPK4可能通过促进胁迫相关基因的表达提高植物的耐盐胁迫能力。35S::GFP:SbCIPK4的瞬时表达与亚细胞定位结果均表明SbCIPK4定位于核内,是一个核蛋白激酶。(3)酵母双杂交筛选结果表明,SbCIPK4与SbCBL5互作,且发现SbCBL5通过N端结构域与其相互作用。Pull-down分析也验证了SbCIPK4与SbCBL5在体外存在相互作用。盐胁迫条件下,SbCBLs与SBCIPKs的协同表达分析表明,两者均受到Na2CO3诱导表达,且SbCIPK4与SbCBL5基因表达量同时显著增强。(4)生物信息学分析结果表明:CK1A基因的调控区域存在大量与光调控相关和胁迫诱导相关的元件。生物芯片和Q-PCR分析表明CK1A在植物生长发育的多个阶段都有较高表达,特别是在植物器官花和种子的发育和成熟过程中表达最高。CK1A RNAi植株在长日照条件下表现出晚花表型,并且开花基因FT、SOC1、和CO都有一定程度的降低,特别是成花素基因FT的表达下调最为明显。成功建立了CK1A激酶结构域的原核表达和纯化体系,得到了纯度较高的CK1A重组蛋白,对重组蛋白的激酶自磷酸化实验证明其具有体外自磷酸化激酶活性。综上,本研究运用多种生物信息学工具和分子生物学方法探讨和阐明了CIPK基因在植物抗盐胁迫中的生理功能及分子机制,以及CK1A基因在植物开花光周期途径中的生物学功能。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q946

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