产胞外多糖植物乳杆菌的分离筛

发布时间：2017-12-30 02:06

本文关键词：产胞外多糖植物乳杆菌的分离筛选、分子表征及其应用研究　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs）是LAB在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的黏液多糖或荚膜多糖。LABEPS具有独特的理化及流变学特性，可作为增稠剂、乳化剂、胶凝剂和稳定剂广泛应用于发酵食品生产中，改善食品的流变学特性、质构和口感等。大量研究表明，LABEPSs还具有促进人体健康和预防疾病的生理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抑制有害菌、抑制菌膜形成、免疫调节、降胆固醇以及降血压等。此外，LABEPSs还可作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长，调节肠道菌群。由于LAB被公认为是安全的（GRAS）食品级微生物，因此其代谢产生的EPS也是安全可靠的，可直接应用于发酵食品中。本文对产EPS乳杆菌的筛选、鉴定、益生特性、EPS的分离纯化、理化特性、生物活性（体外和体内）以及产EPS乳杆菌在发酵乳制品中的应用进行了系统研究。主要研究结果如下：采用菌落拉丝法与EPS定量测定相结合的方法，从西藏灵菇中分离筛选到3株产EPS较高的乳杆菌SKT109、YW11和YW32。通过表型、生理生化、API50CH和16S rDNA方法对菌株进行了鉴定，最终判定3株菌均为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）。以商业菌株鼠李糖乳杆菌GG（L.rhamnosusGG）为对照，研究了3株产EPS植物乳杆菌的体外益生特性。3株菌均对模拟人工胃液（pH3.0，处理3h）、低浓度胆盐（0.3和0.6g/mL，处理3h）和低浓度过氧化氢（0.4mmol/L，处理8h）有较好的耐受性，并具有潜在的肠道表皮细胞黏附能力。菌株YW11对胆固醇、羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子的清除率最高，其次为菌株YW32和SKT109。 3株植物乳杆菌发酵液经煮沸、离心、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冷冻干燥得到粗多糖，粗多糖先后经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱和Sepharose CL-6B凝胶层析柱进行分离纯化。菌株SKT109合成的EPS属于中性多糖，而菌株YW11和YW32合成的EPS均为酸性多糖或者带酸性基团的糖复合物。采用凝胶渗透色谱（GPC）与多角度激光光散射（MALLS）联用法测得菌株SKT109、YW11和YW32EPSs的重均分子量（Mw）分别为2.1×106Da、1.1×105Da和1.03×105Da。单糖组成分析表明，菌株SKT109EPS由果糖、葡萄糖按摩尔比为3:1组成；菌株YW11EPS由葡萄糖、半乳糖按摩尔比为2.71:1组成；菌株YW32EPS由甘露糖、果糖、半乳糖和葡萄糖按摩尔比为8.2:1.0:4.1:4.2组成。扫描电镜（SEM）观察，菌株SKT109EPS呈现许多个立方块紧密堆叠的微观结构，而菌株YW11和YW32EPSs均呈现高度分支的网络微观结构。原子力显微镜（AFM）观察到，3株菌的EPSs在水溶液中均形成许多不同高度的球形肿块，表明EPSs发生了聚集现象。流变学特性分析表明，3株菌的EPSs在水溶液中均表现出假塑性（剪切稀化）。菌株YW11EPS在脱脂乳、低温以及酸性条件下的粘度较大。热重分析（TGA）和差示扫描量热（DSC）分析测得菌株YW11EPS的降解温度为287.7℃，熔点为143.6℃，表明其具有较高的热稳定性。体外生物活性实验结果表明，3株植物乳杆菌EPSs均具有一定的清除DPPH自由基、 OH、O2 的能力和螯合Fe2+的能力，同时也具有一定的总还原能力，其中菌株YW11EPS的抗氧化活性要高于菌株YW32和SKT109的EPSs，这与之前得到的菌株自身的体外抗氧化活性结果相一致。3株菌的EPSs均有不同程度的抑制4种常见致病菌（Escherichia coli O157, Shigella flexneri CMCC (B),Staphylococcus aureus AC1和Salmonella typhimurium S50333）菌膜形成的作用。当人结肠癌细胞HT-29在EPS浓度为600μg/mL下处理72h后，其生长受到明显抑制，菌株SKT109、YW11和YW32EPSs的肿瘤抑制率达到最高，分别为45.10%、52.08%和39.24%。通过建立人结肠癌细胞HT-29荷瘤裸鼠模型，考察L. plantarum YW11EPS的体内抗肿瘤、抗氧化及免疫调节活性。与模型对照组相比，YW11EPS对HT-29移植瘤均有明显的抑制作用，低、中、高剂量组的抑瘤率分别为17.16%、26.26%和36.58%，与药物剂量呈正比。YW11EPS对荷瘤裸鼠体重、肝脏指数、肾脏指数和心脏指数均没有显著影响，但可显著降低荷瘤裸鼠血清中谷草转氨酶（AST）和肌酐（Cr）的水平，恢复谷丙转氨酶（ALT）和尿素氮（BUN）至正常水平，，提高荷瘤裸鼠血液中白细胞（WBC）和淋巴细胞（LYM）的数目，同时提高荷瘤裸鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）水平。可见，YW11EPS具有较好的抗肿瘤和抗氧化活性，且对机体无毒，可开发为具有潜在健康功效食品或辅助药物用于治疗结肠癌。免疫调节活性作用结果表明，YW11EPS可提高荷瘤裸鼠脾脏中自然杀伤细胞（NK）和细胞毒性淋巴细胞（CTL）的细胞毒活性，并可促进荷瘤裸鼠血清中细胞因子IL-10、IL-2和TNF-的分泌，表明L. plantarum YW11EPS主要可能是通过调节机体免疫活性来抑制肿瘤的增长。在产EPS植物乳杆菌的应用研究方面，以生物活性较好的L.plantarumYW11EPS的产量为指标，通过单因素分析法确定其产EPS的发酵条件为：SDM培养基，发酵时间为18h，碳源为乳糖（浓度为15g/L）、氮源为大豆蛋白胨（浓度为15g/L）、发酵温度为32℃、接种量为3%、pH为6.0。选取对L. plantarum YW11EPS产量影响较为显著的三个因素：pH、大豆蛋白胨浓度和接种量，进行响应面分析，得到其产EPS的最佳发酵条件为：大豆蛋白胨浓度13.50g/L、pH6.27、接种量2.70%。在次条件下发酵L.plantarumYW11实际所得EPS产量为131.263mg/L，与预测值129.915mg/L基本吻合。选择具有良好发酵性能（数据未发表）的产EPS L. plantarum SKT109作为辅助发酵剂，与生产发酵剂共同发酵生产发酵乳和Cheddar干酪。结果表明，L. plantarum SKT109在发酵乳中存活能力较强，可提高发酵乳的持水力和流变学特性，改善发酵乳的风味，且不会引发后酸化。L.plantarumSKT109可通过提高干酪中的水分含量、降低干酪的硬度和咀嚼性来改善干酪的质构。干酪成熟12周后，L.plantarumSKT109的活菌数达到7.89log cfu/g，且不会对干酪发酵剂乳酸乳球菌的生长产生不利影响。L. plantarumSKT109对干酪的初级蛋白水解无显著影响，对次级蛋白水解有促进作用，干酪成熟12周后，实验组干酪中的70%乙醇可溶性氮含量、5%磷钨酸可溶性氮含量、pH4.6可溶性氮含量以及游离氨基酸含量均稍高于对照组干酪（P0.05）。此外，L. plantarum SKT109还可对干酪风味的形成产生积极影响。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.3

【参考文献】