新型核糖醇脱氢酶的克隆表达、性质及其合成阿洛糖醇的应用研究

发布时间：2017-12-30 14:54

本文关键词：新型核糖醇脱氢酶的克隆表达、性质及其合成阿洛糖醇的应用研究　出处：《江南大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：糖醇是由糖衍生的有机化合物,含有多种多元醇。由于其所含热量比糖类低,因此被广泛应用于食品中。阿洛糖醇是一种含有6个碳原子的稀有单糖醇,也是D-阿洛酮糖还原途径的主要产物,具有多重生理功能,例如其润肠通便的功能可应用于治疗便秘,抑制脂质堆积的功效可用于抑制肥胖。阿洛糖醇也可以用作抗结晶剂。此外,阿洛糖醇可以交联D-和L-型己糖,在L-阿洛酮糖生产过程中发挥重要作用。微生物全细胞反应和酶促反应多适用于将D-型糖转换为其他种类的糖。核糖醇脱氢酶(核糖醇:NAD+2-氧化还原酶;RDH;EC 1.1.1.56),可催化核糖醇转化生成D-核酮糖且可催化D-阿洛酮糖转化生成阿洛糖醇。本研究将来源于产碱普罗威登斯菌Providencia alcalifaciens RIMD 1656011的新型核糖醇脱氢酶基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功进行了克隆表达。本论文的目的是纯化和表征P.alcalifaciens RIMD 1656011来源的核糖醇脱氢酶,并研究其底物特异性及作为工业用酶的潜力。利用镍柱亲和层析得到纯酶,通过SDS-PAGE和LC-MS分析发现纯酶的分子量在25 000～26 650 Da之间。活性酶的分子量(104k Da)研究表明该酶以四聚体形式存在时具有活性。该酶最适p H为10.0,最适温度为35°C;热稳定性分析显示,在25、30、40、50°C孵育4 h后,原始酶分别能够保留72、72、48、0%的酶活。以核糖醇为底物,该酶的动力学参数Km和kcat值分别为13.9 mmol L-1和10.0 s-1,其催化效率(kcat/Km)为0.71 mmol L-1 s-1;NAD+的Km为0.042 mmol L-1。此外,底物特异性研究表明来源于P.alcalifaciens RIMD 1656011的核糖醇脱氢酶能够直接转化D-果糖生成阿洛糖醇且无副产物生成。在最优生产条件下,D-阿洛酮糖合成阿洛糖醇需要组合使用来源于P.alcalifaciens的核糖醇脱氢酶(RDH)和甲酸脱氢酶(FDH)。将RDH和FDH基因克隆导入到p ET-22b(+)质粒上,然后在大肠杆菌中进行表达,生产得到相对应的酶,并通过优化反应温度、p H、转速(75、100、125、150 rpm)和振荡方式(水平和涡旋)来提高阿洛糖醇的产量。酶反应的最适p H和温度分别为7.5和40°C。研究表明,阿洛糖醇的收率随转速增加而显著提高,在转速150 rpm条件下反应6 h后获得最高收率95.60±0.54%。当水平振荡反应时,阿洛糖醇的收率从100±6.05(无振荡)增加到124.20±9.70%。在最优条件下反应6h,20 mg D-阿洛糖可还原生成16.7±0.62 mg阿洛糖醇,且在反应过程中和结束后均无副产物的生成。利用高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(FT-IR)、液相色谱-质谱(LC-MS)、核磁共振光谱(NMR)分析进行产物鉴定,确定最终分离得到的产物为阿洛糖醇,其纯度为95%。此外,阿洛糖醇的热稳定性质通过差示扫描量热法(DSC)进行测定。因此,以D-阿洛糖为底物,通过组合使用RDH和FDH双酶可成功生成阿洛糖醇。通过同源建模和分子对接研究了来自于P.alcalifaciens RIMD 1656011的核糖醇脱氢酶(RDH),该酶可用于生产阿洛糖醇。将RDH的蛋白质序列通过Swiss Model进行同源建模后,使用Auto Dock Vina软件(5.6版)将获得的三维模型与NAD+和D-阿洛酮糖分别进行分子对接。同源建模和对接的结果显示,RDH和NAD+反应的保守氨基酸残基是Tyr 153、Tyr 92、Ser 17和lys 157,而和D-阿洛酮糖反应的保守氨基酸残基为Gln 67和Asp 61。NAD+和RDH相互作用的得分为-49.84,表明结果较好。辅因子再生是近期的研究热点,目前已经发展了多种方法。工业辅因子再生过程中,酶反应是最常用的方法。甲酸脱氢酶(FDH)是一种催化甲酸氧化成二氧化碳(CO2)的酶。它是NAD+依赖型酶,能使NAD+再生成NADH。本论文研究了利用甲酸脱氢酶从NAD+到NADH的再生过程,并通过同源建模和分子对接探索其酶激活位点,研究对象为来源于Ogataea parapolymorpha DL-1的甲酸脱氢酶。将FDH的蛋白序列通过Swiss Model软件进行同源建模,然后采用Auto Dock Vina软件将得到的三维结构与NAD+进行对接。同源建模和对接的结果表明,FDH与NAD+相互作用的氨基酸残基主要是Pro 68、Arg 258、Asn119、Asn 228和His 97。辅因子NAD+和FDH有很好的相互作用,得分为-60.23,表明结果较好。本研究将阿洛糖醇合成途径和辅因子再生系统在大肠杆菌中进行重构,成功获得通过还原D-阿洛酮糖生产阿洛糖醇的工程菌株。将来源于P.alcalifaciens的核糖醇脱氢酶基因和来源于O.parapolymorpha的甲酸脱氢酶基因进行共表达,分别构建阿洛糖醇的产生途径及持续供应NADH辅因子的再生系统。D-阿洛酮糖经共表达菌株全细胞转化48 h后,阿洛糖醇得率为96%,转化的最适温度、最适p H、D-阿洛酮糖浓度及生物量浓度分别为30°C、7.0、1%、OD600=40。综上所述,该大肠杆菌代谢工程菌可用于大规模生产阿洛糖醇,并有着巨大的应用前景。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55;TS202.3

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