细胞核内m~6A读码器YTHDC1调控mRNA选择性剪切机制研究

发布时间：2017-12-31 13:11

本文关键词：细胞核内m~6A读码器YTHDC1调控mRNA选择性剪切机制研究　出处：《中国科学院北京基因组研究所》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在至今被发现的mRNA化学修饰中,6-甲基腺嘌呤(m6A)是最普遍存在的一种核苷酸甲基化修饰形式。前期的研究发现,在哺乳动物中的平均每条mRNA上存在3-5个m6A修饰,并且它的结合基序为REACH(R=G or A, H=A, C or U)。m6A甲基化修饰是一个动态可逆的过程,它的甲基化转移酶复合物中三个重要组分已被报道,它们分别是METTL3、METTL14和WTAP。在这3个组分中,METTL3与METTL14作为甲基化转移酶的催化亚基而WTAP作为调节亚基。m6A去甲基化酶目前发现的有两种,分别是ALKBH5和FTO。ALKBH5被报道与精子发育有关,而FTO首先在并指突变体小鼠中被发现,随后证明它跟人的肥胖和糖脂代谢有关。m6A去甲基化酶和甲基化转移酶的发现极大的推动了m6A的相关研究。目前发现的m6A读码器有定位在细胞质的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3,以及定位在细胞核的YTHDC1。细胞质m6A读码器YTHDF2和YTHDF 1分别被报道参与mRNA的降解和翻译。然而,对m6A细胞核读码器YTHDC1的研究却知之甚少。YTHDC1被报道定位在YT小体上,而YT小体与核小斑是毗连的,我们推测YTHDC1可能与核小斑内RNA加工蛋白相互作用从而影响RNA剪接过程。为了验证我们的假设,我们结合免疫共沉淀技术和二级串联质谱技术发现了5个与YTHDC1相互作用的SR家族蛋白SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、SRSF10。通过在转录水平上的剪接分析,我们发现YTHDC1、SRSF3以及METTL3能促进外显子保留而SRSF10则促进外显子剪接。为了探究YTHDC1和SR家族蛋白靶向外显子的剪接模式,结合光活性增强的核糖核苷交联和免疫共沉淀测序(PAR-CLIP-seq)以及转录组测序(RNA-seq)数据,我们分析发现YTHDC1和SRSF3促进它们靶向外显子的保留而SRSF10则促进它靶向外显子的切除,而其它SR蛋白并没有显著的偏好性。随后,我们从分析数据中随机挑选2个基因的RT-PCR实验进一步证实了YTHDC1、SRSF3与SRSF10靶向外显子的剪接变化。通过对YTHDC1、SRSF3和SRSF10的结合位点平均距离的分析,我们发现SRSF3在mRNA上的结合位点与YTHDC1在其上结合位点的平均距离比SRSF10更近。通过免疫共沉降技术,我们分别在体内和体外证明了YTHDC1与SRSF3和SRSF10具有直接相互作用,并且SRSF3能与SRSF10竞争性的结合YTHDC1。它们竞争性的结合YTHDC1进一步印证了SRSF3和SRSF10相反的剪接模式。我们猜测SRSF3与SRSF10对共同靶向外显子相反的剪接模式可能是因为它们对RNA的结合强弱变化导致的。通过PAR-CLIP技术结合3’末端生物素标记实验,我们发现当敲低YTHDC1后,SRSF3对RNA的结合信号减弱而SRSF10对RNA的结合信号增强。这说明YTHDC1能招募SRSF3同时抑制SRSF10结合在RNA上,从而导致剪接形式的改变。通过外源回补实验,我们进一步发现野生型的YTHDC1能够回补因敲低YTHDC1引起的SRSF3和SRSF10对RNA的结合能力以及选择性剪接紊乱,但是m6A结合关键氨基酸突变的YTHDC1则不能回补。这说明YTHDC1介导的剪接变化是m6A依赖的。通过对内源YTHDC1、SRSF3和SRSF10的蛋白含量进行检测,我们发现SRSF3在体内的含量远远高于SRSF10,所以很有可能在正常的生理状态下,SRSF3结合大部分的YTHDC1导致它们靶向外显子保留水平占主导。我们的研究为细胞核内m6A读码器YTHDC1影响前体mRNA剪接因子与mRNA结合的选择性剪接调控的机制提供了直接有力的证据。同时为进一步研究m6A的生物功能和RNA表观遗传提供依据,也为正常生理(如干细胞干性维持和分化)或异常病理生命活动(如恶性肿瘤等)关联分子机理提供新的研究方向。
[Abstract]:6 - methyladenine ( m6A ) is the most ubiquitous form of nucleotide methylation modification in the mRNA chemistry found to date . Previous studies have found that there are 3 - 5 m6A modifications on the average of each mRNA in mammals , and that its binding motif is either ( R = G or A , H = A , C or U ) . In order to clarify our hypothesis , we found that there are two types of SRSF10 , SRSF3 , SRSF7 , SRSF9 and SRSF10 , which are located in cytoplasm .

【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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