明永冰川及其退却地区垂直气候带的细菌群落多样性研究

发布时间：2018-01-02 07:43

  本文关键词：明永冰川及其退却地区垂直气候带的细菌群落多样性研究　出处：《昆明理工大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：位于滇西北的明永冰川属梅里雪山山系,深处我国青藏高原东南部生物多样性最为丰富的横断山区,是我国独有的低纬度、高海拔季风性冰川,在水平距离不到15公里的范围内,海拔垂直落差近5,000 m,其间无任何地理隔绝。在该分布区内,形成了完整的冰川-森林-干暖河谷垂直气候带,使得生物多样性集中体现在一个非常狭窄的区域内。本论文以明永冰川及其退却地区垂直气候带的微生物生态分布为研究对象,重点对该地区细菌群落的组成和结构进行了研究。论文首先通过经典微生物纯培养方法,利用四种不同的培养基从明永冰川地区共分离得到37,513株细菌,根据菌落形态分为391株,分离到的绝大部分菌株能在4℃-37℃生长,少部分仅能在4℃-25℃生长。研究结果表明,寡营养培养基PYGV分离得到的细菌种类多于LB和Organnic等富营养培养基,表明PYGV针对冰川地区细菌的分离与鉴定更为合适。对分离得到的部分菌株进行了鉴定,结果表明分离到的菌株大部分为革兰氏阴性菌,分布于4个菌门(变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门)、4个菌纲(丫-变形菌纲、放线菌纲、芽孢杆菌纲、黄杆菌纲)、7个菌目(假单胞菌目、肠杆菌目、黄胞单菌目、链霉菌亚目、微球菌亚目、芽孢杆菌目、黄杆菌目)、7个菌科(假单胞菌科、肠杆菌科、黄胞单菌科、链霉菌科、短杆菌科、芽孢杆菌科、黄杆菌科)和7个菌属(假单胞菌属(Pseudomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和黄杆菌属(Flavobacterium)),其中假单胞菌属最多,在已鉴定过的细菌中占比超过35%,其余6个属的细菌占比不到65%。最后,以分离的部分细菌为宿主对该地区可培养低温噬菌体进行了分离和性质研究,共分离得到6株在4℃仍然可以生长繁殖的低温噬菌体,并对它们的性质进行了初步研究。为进一步探讨针对该地区低温细菌更精细的分类鉴定方法,论文根据细胞膜质组成受温度影响显著的特点,利用来源于三个不同气候带的12株可培养低温细菌,通过气相色谱法分析了它们在低温培养条件下的膜不饱和脂肪酸组成情况,并以不饱和脂肪酸的组成对低温菌做了聚类分析。研究结果表明,绝大部分的细菌分类结果与16S rRNA基因构建的进化关系一致,证明利用膜不饱和脂肪酸组成能对该地区的低温细菌进行科学的分类。同时在研究中发现部分细菌利用新方法能得到比16S rRNA基因分析法更精细的分类地位,证明以膜质脂肪酸组成进行分类鉴定能更好的区分同一种属的低温细菌在亲缘关系上的远近。研究结果也同时证明了经过选择的这些低温细菌细胞膜中的不饱和脂肪酸的比例与温度成反比关系,即温度越低,不饱和脂肪酸的含量越大。虽然大部分不饱和脂肪酸成分与已报道过的其它低温细菌大致相同,但部分低温细菌的脂肪酸组分并不相同,这一现象值得在今后进行进一步研究。为更客观和全面地了解明永冰川地区不同垂直气候带细菌群落的组成和结构,论文采用16S rRNA基因V6高变区测序技术对明永冰川十一个样点的土壤样品的免培养细菌进行了检测和分析。重点对分布于三个垂直气候带中的四个代表性样品进行了分析。研究表明：在4个样品中共包含了21个菌门,42个菌纲,79个菌目,主要优势菌群包括Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes、 Actinobacteria和Nitrospirae等5个菌门。其中Verrucomicrobia菌门为明永冰川独有,尚未在其它冰川微生物的研究中报道过。对不同气候带细菌群落组成通过16S rRNA基因V6高变区测序技术的分析表明,不同气候带的细菌组成主要在菌目这一级别就有显著差异,部分气候带的细菌群落组成甚至在菌门、菌纲这一级别都表现出明显差异,充分说明不同气候带细菌群落组成具有明显的特征。在菌科、菌属这一分类级别中,由于数量过于庞大反而难于归纳出各气候带的细菌群落组成特征。经过对处于优势地位的细菌群落分析后证明：在菌属这一级的分类中,棒状杆菌属(Corynebacteriu)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和链球菌属(Streptococcus)三个菌属在各个气候带排名前十优势菌属的组成上都有出现,说明它们在该地区分布最为广泛,与环境有较好的适应性。假单胞杆菌属(Pseudomonas)的细菌在所有样品中都有分布,但在排名前十的优势菌属中只有寒温带与接近寒带的样品中可以发现它们,初步表明此属细菌在低温的环境下能更好的生长,是该区域的优势种群之一,这一结果也间接印证了该地区可培养细菌分离的结果。在论文的最后,我们利用宏基因组测序的方法对位于中温带与寒带之间的寒温带的土壤样品进行了分析,在16S rRNA基因V6高变区测序技术分析结果中,此气候带的细菌多样性相对比较低,在优势细菌群落的组成上与相邻的两个气候带有较大不同。经过对总量约30G的测序数据进行整理分析后表明,仅针对细菌的物种注释该区域就发现了44个菌门和49个菌纲,证明了明永冰川地区有丰富的细菌多样性。经过对16S rRNA基因V6高变区的测序结果进行对比分析,发现主要的优势菌群在门、纲和目级三个分类级别中排名前十的细菌中,分别有6个菌门、5个菌纲和3个菌目组成相同,但是在具体到每个优势菌群所占比例上又有所差异,而在科或科以下的分类级别中,两种方法中排名前十的优势菌种几乎没有一致性。造成这一差异的原因可能存在以下几个方面：首先由于16SrRNA基因测序分析法必须经过一个PCR扩增过程,而不同细菌模板DNA的扩增倍数不一样,最佳扩增条件也可能不同；其次,两种方法的物种注释方法及数据库存在有明显的差别。总的来看,宏基因组测序所达到注释物种的覆盖率要远远大于16S rRNA基因V6高变区测序法所能达到的覆盖率。表明该方法对复杂生态环境中微生物群落研究具有更好的覆盖率,有利于更完整地体现特定生态环境中微生物的组成情况,只是该方法目前费用较高,从研究的经济性上有一定的限制。利用宏基因测序数据开展的代谢途径研究中我们发现本区域细菌中的热点信号通路多集中在了环境信息加工、遗传信息加工和新陈代谢三个方面；而在相关功能模块的统计中,在已知的功能基因中,氨基酸的运输与代谢相关的基因、信号的转导机制相关的基因和能量的生产和转变相关的基因排在前三位,这与信号通路中的热点基本吻合。对比各种方法得到的结果,纯培养方法在11个采样点分离得到的全部细菌来自于4个菌门,4个菌纲；免培养法的16S rRNA基因V6高变区高通量的测序分析在4个采样点得到的全部序列则来自于21个菌门,42个菌纲；宏基因组方法在一个采样点得到44个菌门,49个菌纲。从以上结果我们不难看出几种方法在研究细菌群落分布上各有各的特点：纯培养方法主要针对可培养微生物,在得到基本细菌组成的同时可以得到一批珍贵的可培养细菌,但得到的细菌种类受分离条件的限制,种类较少；而基于16S rRNA基因V6高变区的高通量测序分析的免培养法针对细菌,可以较为迅速和经济地得到一个区域内细菌种群的组成与结构信息,但对该地区细菌相关代谢通路及功能基因则无法了解；而宏基因组学方法则可以较为详细了解一个区域内的物种组成、代谢通路和功能基因,而且该方法的物种注释还可以扩展到除细菌外的其它微生物种群,有利于更全面地了解特定环境中所有生物群落的组成,但该方法依然受到检测价格高、样品总DNA的提取方法、测序手段的限制,而在得到海量数据后还受到生物信息分析技术、样品复杂度和测序深度的影响,当然随着技术的不断进步,我们相信宏基因组分析方法将是未来进行环境群落和代谢分析的重要手段。论文通过纯培养、免培养方法、膜不饱和脂肪酸组分分析法以及宏基因组等方法,对明永冰川不同气候带的细菌群落分布等进行了系统地调查和分析。首次从不同角度和尺度对低纬度、高海拔的明永冰川地区的细菌群落组成及多样性进行了调查,并对各个不同的垂直气候带之间的细菌群落的分布使用多种方法进行了综合研究。是从宏观到微观的一次系统性调查和资源收集,使得这一独特地理环境的微生物生态研究更加系统化。论文首次利用气相色谱法,根据膜不饱和脂肪酸组成的不同对该地区分离得到的12株低温细菌开展了分类学方法的研究,结果表明该方法的结果不仅与基于16S rRNA基因序列分析得到的结果一致,而且相比后者更为精细,是对该地区微生物尤其是低温细菌进行分类的一种重要方法,该方法也可望用于其它地区低温细菌的精细分类。研究中还分离得到了一批可培养的低温噬菌体及其宿主菌,积累了大量的微生物资源,为今后在实验室中进一步开展噬菌体的低温适应性机制、噬菌体与宿主的相互作用及噬菌体与宿主的协同进化机制等研究提供了珍贵的实验材料。本研究的结果不仅使得这一独特地理环境地区的微生物生态研究更加系统化,也为进一步在该地区开展生物地球化学、微生物生态学及挖掘微生物资源奠定了基础。
[Abstract]:Located in the northwest of Yunnan Mingyong Glacier belongs to the Meili Xue Shan mountains, the depths of our country southeast of the Tibetan Plateau biodiversity is most abundant in the Hengduan Mountains, is China's unique low latitude and high altitude monsoon glaciers, horizontal distance in the range of less than 15 kilometers, the elevation drop of nearly 5000 m, there is no any geography isolated. In the distribution area, the formation of a complete glacier - Forest - dry warm valley vertical climatic zones, the biodiversity is reflected in a very narrow range. In this paper, Mingyong Glacier and retreat area vertical climatic zones of microbial ecological distribution as the research object, the composition and structure of bacteria community in the region was studied. Firstly, through the method of classic pure culture microorganisms, using four different kinds of culture medium from Mingyong Glacier area 37513 bacteria strains were isolated, divided into 391 strains according to the colony morphology, 鍒嗙�诲埌鐨勭粷澶ч儴鍒嗚弻鏍�鑳藉湪4鈩，

本文编号：1368332