SlCycB2调控植物多细胞表皮毛形成和花器发育的机制研究

发布时间：2018-01-16 02:23

  本文关键词：SlCycB2调控植物多细胞表皮毛形成和花器发育的机制研究　出处：《华中农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：植物表皮毛对抵御生物和非生物逆境具有重要作用,同时也是一种研究植物细胞命运调控的模式系统。拟南芥单细胞表皮毛形成受到MYB/bHLH/WD蛋白复合体的调控,该复合体通过激活下游表皮毛起始关键基因的表达,导致表皮细胞膨大而异化成表皮毛。番茄、烟草等多细胞表皮毛的调控机制不同于单细胞表皮毛。到目前为止,番茄、烟草等多细胞表皮毛的形成机制尚未被揭示。表皮毛的形成离不开细胞周期的调控,细胞周期蛋白在不同细胞周期的转变过程中起到重要作用。花器官发育的研究具有重要的生物学意义,目前确定ABCDE模型可以用来揭示花器官形成调控机理。但是,本研究中的新型B型细胞周期蛋白是否参与花器官形成的调控还未可知。本研究主要对SlCycB2基因在番茄、烟草和拟南芥中的同源基因进行了鉴定,并在番茄和烟草中进行了功能分析。主要的结果如下:1.利用SlCycB2基因编码的氨基酸序列在SGN、TAIR和NCBI等数据库中筛选同源基因。在番茄中确定2个同源基因,命名为SlCycB3和SlCycB4;在烟草中确定3个同源基因,分别命名为NtCycB2、NtCycB3和NtCycB4;在拟南芥中确定2个同源基因,命名为AtCycB2和AtCycB3。一级结构分析发现这类基因均只有一个外显子,编码100多个氨基酸,具有三个保守区。将该类基因与番茄、烟草和拟南芥中的功能已知的B型细胞周期蛋白进行系统进化树分析,结果显示它们是一类新型的B型细胞周期蛋白。2.利用番茄、烟草和拟南芥中SlCycB2的同源基因所编码氨基酸序列在NCBI中进行Protein Blast分析,确定不同物种均含有SlCycB2的同源基因,且功能未知。该结果表明SlCycB2基因以及在不同物种的同源基因可能具有重要的生物学功能。3.SlCycB2和SlCycB3的组织表达谱分析结果显示这两个基因在番茄各个组织中都有表达,在花和叶中的表达最高。亚细胞定位分析确定SlCycB2所编码蛋白定位于细胞核中。SlCycB2基因启动子序列分析发现其中有多个光响应元件。对栽培番茄Ailsa Craig进行光照和暗处理,测定SlCycB2和SlCycB3基因的表达量,结果显示二者均受到光的诱导,受到暗条件的抑制。构建SlCycB2基因启动子驱动GUS-YFP融合表达载体,转化番茄并分析该基因的表达特点,实验结果表明该基因在下胚轴、茎表皮毛、叶表皮毛、花中的柱头和未成熟的果实中都有表达,且在表皮毛的腺体中高表达。4.转基因功能分析确定SlCycB2基因参与调控番茄表皮毛的形成。SlCycB2超量表达载体和RNAi抑制表达载体分别导入到栽培番茄AC获得转基因植株。qRT-PCR分析结果显示SlCycB2基因的表达水平在超量表达转基因植株中显著上调,而在抑制表达转基因植株中显著下调。SlCycB2超量表达植株中表皮毛密度显著减少,非腺体毛和I型腺体毛几乎消失,VI和VII型腺体毛的密度显著降低。而在SlCycB2-RNAi抑制表达植株上表皮毛密度显著增加,且主要是III型和V型非腺体毛显著增加,而且茎上形成了III type-like超长毛,其他类型的表皮毛没有明显变化。5.SlCycB2超量表达植株叶片萜类含量的测定结果显示与对照AC相比,SlCycB2超量表达植株叶片中萜类化合物(包括单萜和倍半萜)的含量极显著降低。萜类化合物对生物具有重要的防御作用。因此,分析了转基因材料对斜纹夜蛾的抗性实验,结果表明SlCycB2超量表达植株更易遭受斜纹夜蛾的啃食。综合这些结果,推测SlCycB2基因可能通过调控VI型表皮毛的形成,影响萜类物质的生物合成,进而影响其生物防御的效果。6.转基因功能分析还表明SlCycB2基因调控番茄花器官的发育。SlCycB2超量表达植株表现出花药开裂,花柱变短的表型,坐果率显著降低。SEM观察发现畸形花粉显著增加,花柱细胞变短和柱头乳突细胞畸形。实验结果表明SlCycB2参与调控番茄花柱和花粉的发育。7.RNA-seq分析结果表明,SlCycB2超量表达植株和对照AC植株之间具有241个差异表达基因(DEGs);SlCycB2-RNAi抑制表达植株和对照AC之间有84个差异表达的基因;SlCycB2超量表达植株和SlCycB2 RNAi植株之间有834个差异表达基因。对DEGs进行功能聚类分析,发现这些DEGs主要参与萜类代谢、角质蜡质合成和蛋白酶抑制因子的合成等途径。这暗示了SlCycB2超量表达植物中次生代谢物(如萜类化合物)的减少导致其对食草性昆虫的防御力减弱。8.转基因分析结果显示SlCycB2在不同物种的同源基因具有相同的多细胞表皮毛调控功能。利用pMV2载体构建了SlCycB3、SlCycB4、Nt CycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3基因的超量表达载体,利用pHELLSGATE2构建了SlCycB3和SlCycB4的RNAi抑制表达载体,遗传转化获得转基因植株。利用qRT-PCR和RT-PCR检测目的基因的表达水平,确定这几个基因在超量表达植株中均上调表达;SlCycB3和SlCycB4在RNAi抑制表达植株中均下调表达。表型分析发现SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2超量表达转基因植株的表皮毛密度显著减少;SlCycB3-RNAi抑制表达植株的表皮毛密度显著增加,说明这类基因具有相同的多细胞表皮毛调控功能。9.SlCycB2、SlCycB3、NtCycB2和AtCycB2超量表达番茄植株中SlCycB2和SlCycB3的表达量进行测定,结果显示在Nt CycB2和AtCycB2超量表达转基因番茄植株中SlCycB2和SlCycB3基因都下调表达;在SlCycB3超量表达番茄植株中SlCycB2基因亦下调表达;同样,在SlCycB2超量表达植株中SlCycB3也下调表达。推测这类基因可能受其同源基因的表达水平的影响。10.构建的SlCycB3、SlCycB4、NtCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3超量表达载体遗传转化烟草获得转基因植株。表型分析确定SlCycB2、SlCycB3、AtCycB2和Nt CycB2转基因植株的表皮毛密度显著降低,而SlCycB4、AtCycB2、NtCycB3和NtCycB4转基因植株的表型没有变化。SEM观察发现SlCycB2和AtCycB2转基因植株中长柄和短柄腺体毛密度都显著减少。因此推测茄科作物可能具有相似的多细胞表皮毛调控途经。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

相关博士学位论文 前2条

1 杨长宪;番茄Wo基因调控表皮毛形成和胚胎发育的机理解析[D];华中农业大学;2011年

2 欧阳波;几种病程相关蛋白基因转化番茄的研究[D];华中农业大学;2003年

相关硕士学位论文 前2条

1 苗青;番茄Sly-miR167启动子的分离与调控分析[D];重庆大学;2011年

2 侯政;利用酵母双杂交系统筛选与番茄RIN互作蛋白的初步研究[D];华中农业大学;2009年

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本文编号：1431135