拟南芥Armadillo蛋白ZAK IXIK与F-box蛋白SAP相互作用参与花器官发育

发布时间：2018-01-19 14:46

本文关键词： 胚胎发育花器官发育 ZIX SAP 蛋白降解　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：显花植物的花包含雌蕊和雄蕊两种生殖器官,分别产生雌、雄配子体。开花时,在雄蕊的花药中所产生的雄配子体(花粉)被释放和传递到雌蕊的柱头上,经过水合萌发出花粉管,经引导组织最后进入胚珠中的雌配子体(胚囊)并释放所携带的两个精细胞,分别与卵细胞和中央细胞融合完成双受精作用。卵细胞授精后形成的合子发育成胚胎,并进一步发育成一棵植物。因此,花的发育以及胚胎的发育对于植物完成世代交替至关重要,是植物生产种子进行繁衍的基础,与农业生产密切相关。研究花及胚胎发育的分子遗传机制不仅可以了解花发育和胚胎发育的遗传机制,也可为农作物栽培和育种提供理论参考。我们研究组在前期的研究工作中,分离鉴定到了两个由Ds转座子插入产生的胚胎发育缺陷突变体kd616和sgt4712。分子生物学分析显示,这两个突变体中的Ds元件都插入在同一个编码Armadillo蛋白的基因AT4G00231中。最近,AT4G00231被命名为Z4A IXIK(ZIX),因此我们把kd616和sgt4712分别改名为zix-1和zix-4。遗传和表型分析显示,这两个突变体都不影响雌、雄配子体的形成与发育,但严重影响胚胎的发育,造成胚胎发育停滞在球形胚时期,导致种子败育,不能产生纯合突变体植株。本论文是在原有研究进展的基础上进一步分析鉴定了 zix-1和zix-4突变体及ZIX的功能和作用机制。表达模式分析结果显示,ZIX是一个组成型表达的基因,在分裂旺盛的组织中有较高表达,暗示它可能在除了胚胎以外的其它植物组织也起作用。因此,利用胚胎特异表达基因ABI3的启动子驱动ZIX基因在zix-1中表达进行胚胎拯救实验,构建了由胚胎拯救所获得的纯合zix突变体系EmR-zix-1。EmR-zix-1突变体植株表现出严重的多样性生长发育缺陷,主要表现为:植株生长矮小不能开花;或植株生长正常能开花,但花器官发育出现严重缺陷,包括花瓣残缺或缺失、雄蕊数目和发育异常、花药药室发育缺陷、雌蕊顶部融合缺陷及心皮不融合、胚珠裸露等。用EmR-zix-1植株花序为材料进行RNAseq分析显示,ZIX基因突变会影响很多基因的表达,包括与细胞信号转导、转录调控、氧化还原反应、物质转运、胁迫响应和代谢等方面相关的基因。与野生型相比,EmR-zix-1植株中,一些与花器官发育相关基因的表达受到了显著的影响。而在一些花发育同源异型基因突变体中,ZIX基因的表达量也发生变化。这些研究结果显示,ZIX除了对胚胎发育至关重要外,在花发育中也起重要作用。ZIX基因编码一个54 kD的含475个氨基酸的Armadillo(ARM)蛋白。该蛋白与其它物种中的Arm蛋白相似性较低,但其C末端有一个保守的Ataxin10同型结构域。预测其高级结构为典型的右手超螺旋的螺线管结构。结构分析显示ZIX蛋白可能形成同源聚合体,并通过结合生物大分子如DNA或者蛋白质发挥作用。BiFC、LCI、pull-down和Native PAGE实验的结果显示,ZIX蛋白能够形成同源聚合体。利用串联亲和纯化的方法进行免疫沉淀分析,获得了一个与ZIX互作的候选蛋白SAP。进一步的pull-down、BiFC、LCI和Co-IP实验也证明了 ZIX能够与SAP相互作用。ZIX和SAP蛋白的亚细胞定位结果显示ZIX蛋白定位于胞质和细胞核内,SAP蛋白定位于细胞核内,说明它们的亚细胞定位具有一定的重叠性。表达模式分析发现,SAP基因也在拟南芥多个组织中表达,特别是在花序和角果中高表达,这与ZIX基因的表达位置也具有重叠性。此外,利用CRISPR/Cas9系统构建的cas9-sap-92纯合突变体和从Kaufmann实验室获得的sap-flag/-进行表型比较分析的结果显示,这些纯合sap突变体在花发育方面具有与胚胎拯救zix突变体(EmR-zix-1)相似的表型,如:花瓣残缺或缺失、雄蕊的数目和发育异常和部分雌蕊心皮不融合等。但是这些sap突变体没有胚胎缺陷的表型,不同于具有胚胎发育缺陷导致种子败育表型的ziix突变体。这些结果显示,ZIX可能是通过与SAP互作在花发育中起重要作用,但不清楚SAP是否也与胚胎发育相关。转录激活试验结果显示,ZIX-BD融合蛋白在酵母中具有转录激活活性,暗示ZIX可能具有激活基因转录的功能。Cell free降解实验显示,ZIX蛋白在体外不稳定,并且这种不稳定性能够被蛋白酶抑制剂MG132抑制,推测该蛋白可能经26S蛋白酶体途径降解。分别利用从S4P过表达、突变体和野生型植株中提取的总蛋白处理体外纯化的GST-ZIX蛋白进行降解试验,发现来自突变体中的总蛋白提取液不能促进GST-ZIX的降解,而来自过表达材料的总蛋白提取液与来自野生型植株的一样,能促进GST-ZIX的降解。在S4P过表达和sap突变体植株中,ZIX基因的表达量与野生型中的相比没有明显差异。在SAP过表达植株中,ZIX蛋白的含量与野生型的相比也没有差异,但在sap突变体植株内有所升高。这些结果表明,ZIX可能是SAP的一个靶标蛋白,SAP可能通过调节ZIX蛋白的降解,从而调控下游基因的表达。综上所述,ZIX基因不但对胚胎发育至关重要,而且还通过与SAP互作在花的发育中起重要作用。这些研究结果为了解胚胎和花发育的遗传机制提供新的线索,对认知Armadillo蛋白基因在植物发育中的作用也具有重要意义。
[Abstract]:In this paper , the development of pollen and the development of embryonic development are very important to the development of plants . These two mutants have been named Z4A IXIK ( ZIX ) . The results of these studies show that the ZIX protein can form homologous polymer . The results of these studies show that the ZIX protein can form homologous polymer . The results of these studies show that ZIX protein can form homologous polymer . The results show that the ZIX protein can form homologous polymer .

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

【参考文献】