中度嗜盐新种黄河盐单胞菌盐胁迫的适应机制研究

发布时间：2018-01-28 22:53

  本文关键词： 黄河盐单胞菌 盐胁迫 相容性溶质 适应机制　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：中度嗜盐菌是一类在3-15%盐浓度间有最佳生长表现的细菌,其胞内相容性溶质的积累在盐适应机制中发挥着重要作用。从极端环境中筛选鉴定嗜盐微生物,分析其相容性溶质积累的规律,挖掘相关功能基因,并揭示其盐胁迫适应的分子机制,对于利用这些功能基因创制新种质、改良盐碱地及开发新型生物技术产品等具有重要的理论与实际意义。本研究鉴定了一株盐单胞菌新种,测定了其主要相容性溶质的积累变化,并利用全基因组测序技术和RNA-Seq转录组测序技术,对这些相容性溶质合成、代谢和转运的相关基因进行了鉴定和进化分析,并预测其适应盐胁迫的分子机制。主要研究结果如下：1.对分离自黄河三角洲盐碱土壤的一株编号为BJGMM-B45T的菌株进行生理生化鉴定、16SrDNA序列系统发育分析和DNA-DNA杂交同源性测定,确定菌株BJGMM-B45为盐单胞菌属的一个新种,命名为黄河盐单胞菌(Halomonas huangheensis sp. nov.)。该菌为革兰氏阴性、需氧、杆状,其生长氯化钠浓度范围为0.5-25%,属于中度嗜盐菌。2.分析测定了该菌在7种不同盐浓度培养基中的生长情况,以及Na+、K+和8种相容性溶质的积累情况。结果表明,黄河盐单胞菌BJGMM-B45T在2-15% NaCl的LB培养基中生长最好,胞内积累的相容性溶质主要是谷氨酸、甘氨酸甜菜碱、四氢嘧啶和脯氨酸,但是在不同盐浓度下,它们的含量差别很大。在所有7个盐浓度下,谷氨酸含量都远远高于其它三种相容性溶质的含量。5-18%NaCl范围内,四氢嘧啶是第二大相容性溶质,其含量随NaCl浓度的升高而降低。NaCl浓度升至20%时,甘氨酸甜菜碱含量超过了四氢嘧啶。脯氨酸在各个盐浓度下只有很少量的积累。3.利用Illumina Hiseq2000结合第三代测序技术,完成了该菌的全基因组测序及功能注释。结果表明,黄河盐单胞菌基因组大小为4.7 Mb,GC含量达58.5%,编码3993个CDS、12个rRNA基因和63个tRNA基因。对所有基因进行了COG功能注释,通过KEGG比对,分析了四氢嘧啶、甘氨酸甜菜碱和谷氨酸的合成途径,鉴定了其合成基因和调控因子29个,其中6个属于新预测的,分别为eutC、betA3、betA4、betI、glnA2和glnA3。进化分析结果表明,该菌中这三种物质的合成酶基因与伸长盐单胞菌中相应基因的进化距离非常近。通过基因组数据预测的betA3与编码黄河盐单胞菌胆碱脱氢酶的betA2基因亲缘关系最近,betA4与编码紫色色杆菌的betA基因的亲缘关系最近,glnA2和glnA3与黄河盐单胞菌编码L-谷氨酰胺合成酶的glnA4基因亲缘关系最近。4.1%、10%和18%NaCl浓度下黄河盐单胞菌BJGMM-B45T的转录组分析结果表明,三种盐浓度下共有10个基因高度表达,分别为蛋白解聚分子伴侣clpB基因、分子伴侣dnaK、groEL以及GroEL的合作伴侣groES基因、冷激蛋白cspA基因和肽链延长因子tuf,还有4种功能未知的基因rna43、ompW、AR456_RS11745和AR456_RS04905,推测这些基因可能在适应盐浓度大范围波动和应对外界高盐胁迫的过程中发挥重要作用。不同盐浓度条件下的基因差异表达结果显示,以1%NaCl组为对照组时,10%NaCl组表达量上调的基因有82个,表达量下调的有109个；18%NaCl组表达量上调的基因有224个,表达量下调的有180个。5.不同盐浓度下谷氨酸、甘氨酸甜菜碱、四氢嘧啶和脯氨酸合成代谢相关基因的转录组分析结果表明,盐浓度为10%时,谷氨酸的大量积累主要通过putA的显著上调来实现；盐浓度升至18%时,gltA显著上调,催化谷氨酰胺合成谷氨酸,同时激活谷氨酰胺ABC转运系统,细胞从外界吸收大量谷氨酰胺,用以合成更多谷氨酸来应对高盐胁迫。四氢嘧啶随着盐浓度的升高,ectB、 ectC和lysC上调,其合成既可以从天冬氨酸半醛开始,也可以从L-天冬氨酸开始。甘氨酸甜菜碱的积累首先通过BCCT转运系统的3种基因不同程度上调将更多的胆碱转运入细胞内,当盐浓度升高时,通过增强BCCT转运系统的表达,并启动另一种转运系统即胆碱转运蛋白BetT从环境中吸收胆碱、肉碱和甜菜碱,同时通过betAl、betBl和betI的显著上调来合成更多的甘氨酸甜菜碱来协同应对高盐胁迫。脯氨酸的少量积累主要是通过脯氨酸：钠协同转运载体SSS2的显著上调来实现的。综上所述,本论文在鉴定中度嗜盐菌新种的基础上,从生理学、基因组学和转录组学的角度深入系统地分析了黄河盐单胞菌在盐胁迫下的适应机制,为深入挖掘该菌适应盐胁迫的功能基因及相容性溶质未来的开发应用奠定了基础。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q935
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本文编号：1471769