基于液滴微流控的病毒颗粒检测与分选关键技术研究

发布时间：2018-01-29 07:47

本文关键词： 液滴微流控荧光检测介电泳分选高通量病毒颗粒　出处：《哈尔滨工业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：病毒是自然界中数量最多的微生物,它导致的大规模传染性疾病如SARS、埃博拉等,给人类的生命财产安全带来巨大损失。病毒性疾病之所以传播迅速,究其原因是其变异速度极快,同时传统的医学检测方法对其检测效率较低所致。因此,如何快速、准确的对病毒进行定量检测与分选是现代生物学研究的紧迫问题。液滴微流控技术以其高通量、速度快的特征已成为近年来微流控技术的主流科研热点,它在生物颗粒的精确定量与快速检测方面独具优势。基于此,本文以液滴微流控技术为出发点,面向生物颗粒的高通量、快速检测等关键科学技术问题开展研究,以期实现对病毒等生物样品的精准检测,为疾病的早期诊断、快速治疗等提供理论依据与技术支撑。本文首先以微纳尺度流体流动的视角出发,分析了微通道内两相流的基本理论,提出了综合利用液滴及介电泳技术实现高通量颗粒检测与分选的新方法;给出了液滴的生成、运动及电场操纵颗粒的控制方程,并分别建立了相应的仿真模型,数值模拟了液滴生成规律及分选的结构设置原则。为验证理论研究的正确性,对液滴的生成、检测与分选进行了实验研究,为后续应用研究奠定理论基础。为能够在大量不具有突变RNA的病毒样本中,快速定位并准确定量检测突变RNA病毒,进而遏制病毒性传染病的变异与传播,本文将液滴微流控技术的高通量特性应用于RNA病毒定量检测中。以直径为30 nm的鼠类诺瓦克病毒株MNV-1为研究对象,搭建基础高通量液滴微流控系统,实现单个病毒RNA分子的精确包裹。根据泊松分布原理,准确稀释病毒样品使得每个液滴中的病毒RNA模板数量不超过1个。依托该系统,实现1000个/秒的高通量液滴生成速度,同时控制液滴直径精确为25μm,体积为12.5 p L。在单个液滴中实现了一步法逆转录的PCR扩增,并搭建了高通量液滴的荧光信号检测平台,通过检测分析统计了有(N+)/无(N-)荧光的液滴数量,进而计算了样品溶液中病毒的浓度(基因组/m L)。实验研究验证了液滴微流控系统进行定量分析的高灵敏度、高通量特性。在病毒定量检测的基础上,准确检测其感染特性是阻断其生命进程的核心步骤,而这一步骤则需要在基础液滴微流控系统中合理耦合加样、混合等功能。搭建了具有在液滴中进行取样和注入功能的复合液滴微流控系统,提出了一种不依托细胞培养的、可快速及时检测病毒滴度的新方法。通过该系统同时包裹了具有感染力的病毒颗粒和宿主细胞,生成了大量的、尺寸均匀的微尺度液滴,并对孵育后的液滴微反应器进行病毒RNA分子取样和RT-PCR试剂注入操作。为分析液滴中病毒感染细胞事件,对液滴中的病毒RNA分子进行基因扩增,搭建微流控液滴的荧光信号检测平台,通过检测有/无荧光信号液滴的数量,计算了样品溶液中病毒的滴度(PFU/m L)。通过分析病毒裂解量Bs和病毒基因组数量与病毒空斑形成单位数量之间的比例Rg,对复合液滴微流控系统功能进行优化。利用液滴微流控的病毒滴度分析平台,实现抗体的中和效率测试,并与传统方法进行对比分析,说明复合液滴微流控系统的优越性。重组病毒的产生频率非常稀少却具有产生高风险、高致病率病毒变异株的风险,因此在大通量样本中分选低拷贝数重组病毒并进行定量检测是生物学研究的技术瓶颈。搭建了具有分选功能的复合液滴微流控系统,对病毒溶液中单个重组病毒进行包裹和差异化PCR进行扩增,设计并验证了基于重组病毒的PCR扩增反应体系。依托高通量的液滴的检测和分选平台,对液滴中的重组病毒进行检测、计数、分选操作,液滴的分选频率可高达800个/秒。结合液滴的检测、分选和基因测序技术,确定了病毒重组发生的频率和发生在基因片段上的准确位置。通过高通量液滴微流控检测平台,解决了现有的重组病毒检测方法无法有效区分真实病毒重组现象和人工重组产物的问题,实现了液滴微流控技术对低拷贝数重组病毒的精准分析。
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【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373

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