三唑锡对斑马鱼生殖内分泌干扰作用及分子机制研究

发布时间：2018-02-02 12:15

本文关键词： 三唑锡斑马鱼性腺轴类固醇激素内分泌干扰生殖毒性　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：农药作为农业生产的重要投入物资,对人类粮食供给做出了巨大贡献。然而由于农药的长期大量使用,其对生物多样性也产生了严重的破坏,对人类健康及内分泌干扰存在着潜在的威胁。即使环境和食品中微量的农药残留也可能对人体产生影响,干扰内分泌机能,引起性激素失常以及生殖障碍等,因此农药引起的内分泌干扰已成为全球性的一个重大问题。故此,本论文研究了我国当前广泛使用的杀菌剂三唑酮、除草剂莠去津以及杀螨剂三唑锡对斑马鱼性激素干扰及生物标志物基因的变化效应,继而进一步研究三唑锡对斑马鱼的生殖毒性,类固醇激素的干扰效应以及相关功能基因的调控作用,探讨了其可能的分子机制。研究结果主要包括以下几个方面：1、以三唑酮、莠去津和三唑锡为试验研究对象,雌性斑马鱼成鱼暴露21天,监测与抗雌激素效应有直接因果关系的效应生物标志物era,vtg基因,以及激素雌二醇(E2)的变化为终点指标研究了对斑马鱼性激素干扰作用。结果表明：雌性斑马鱼暴露于0.45μg/L三唑锡中,体内E2显著下降,使得雌激素应答基因(era, vtgl)表达量显著下降,显示出明显的抗雌激素效应。2、参照OECD 229试验方法,用0.09μg/L,0.45μg/L三唑锡暴露成熟期斑马鱼21天,检查了对斑马鱼繁殖的影响,同时取性腺进行了组织切片的观察。结果表明：斑马鱼平均产卵量随着三唑锡暴露浓度的增加而显著降低；0.09μg/L和0.45μg/L处理组均可引起斑马鱼雌性成鱼的性腺指数显著降低,但并未引起雄性成鱼性腺指数的显著变化；卵巢组织损伤主要表现为初级卵母细胞(PO)百分比和闭锁细胞(AO)百分比显著增加,而成熟卵母细胞(LMO)百分比显著减少；精巢组织损伤主要表现为精母细胞(Sc)的百分比显著增加,而精子细胞(Sz)的百分比显著减少。表明三唑锡染毒暴露能够影响正常的产卵并产生一定程度的生殖毒性。此外,性腺中三唑锡的积累也可能导致排卵障碍,进而影响配子形成；同时在斑马鱼鱼卵中检测到积累性的三唑锡,证明三唑锡可经亲代(FO)暴露、在性腺中积累而传递给子代(F1),而F1代孵化的畸形率随着三唑锡暴露浓度的增加而显著增加,表明亲代暴露于三唑锡可引起子代发育的毒性效应。3、采用UPLC-MS/MS技术,对斑马鱼性激素合成途径中涉及到的13种激素进行定量测定,并对性激素代谢物进行了初步的鉴定。结果表明：三唑锡染毒暴露处理能够抑制斑马鱼体内促黄体激素(LH)的分泌,进而抑制了雌激素的合成,导致雄激素水平相应升高。同时,三唑锡还可以通过抑制性腺中促性腺细胞成熟的前体激素17P4的合成,干扰了体内胁迫激素。通过对肝脏中雌激素代谢物的分析鉴定,发现雌激素甲基化修饰物,表明三唑锡可促进斑马鱼体内雌激素的代谢速率。4、采用Rt-PCR技术,对斑马鱼性腺轴(HPG)参与类固醇激素合成、转运及代谢等相关基因进行了研究。结果表明：(1)0.45 μg/L三唑锡、100 μg/L法倔唑的暴露处理,可显著下调斑马鱼脑中促黄体激素(lhβ)基因的表达；法倔唑暴露处理组显著下调斑马鱼脑中细胞色素P450酶系cyp19a1b基因的表达；(2)0.45μg/L三唑锡暴露处理可显著上调斑马鱼性腺中3p-甾体羟基脱氢酶(3/3-hsd),17β-甾体羟基脱氢酶3(17(17β-hsd3)基因的表达；100μg/L法倔唑暴露处理可显著上调斑马鱼性腺中细胞色素P450酶系cyp17和17p-甾体羟基脱氢酶1 (17β-hsdl)基因的表达。三唑锡对雌性斑马鱼暴露处理的低剂量组可抑制卵巢芳香化酶(cyp19a1a)基因的表达,而高剂量组却促进了芳香化酶基因的表达；对雄性斑马鱼显示了三唑锡均显著抑制精巢cyp19a1a基因的表达；(3)斑马鱼肝脏中雌激素受体(era)基因的表达在所有暴露处理组中均显著下调。0.45μg/L三唑锡和100 μg/L法倔唑暴露处理组显著下调了斑马鱼肝脏中卵黄蛋白原1(vtg1)和卵黄蛋白原2(vtg2)基因的表达；但在三唑锡暴露处理组中细胞色素P450酶系(cyp1al),儿茶酚-O-甲基转移酶(comt),葡萄糖醛酸转移酶(ugt1a)和谷胱甘肽-S-转移酶(gstp1)代谢相关基因的表达均显著上调,而芳香烃受体(ahr2)在雌鱼肝脏中表达显著下调；100μg/L法倔唑暴露处理组可显著上调斑马鱼肝脏中comt和gstp1基因的表达,在雌鱼暴露处理组可显著上调ahr2、 cyplal和ugt1a基因的表达,但在雄鱼肝脏中的表达量却没有变化；5、采用主成分分析法,评估了所测基因的基因表达和性激素含量以及繁殖的相关性。结果表明：雌鱼中,PC1主要受到fshfβ, Ihβ, cypl9ala,17β-hsd3, vtgl, ugtla和gstp1基因的影响,并且和T,E2,E1,AE,P4,17P4等6个类固醇激素以及繁殖力显著相关；雄鱼中,PC1主要受到Ihβ，，fshβ, cypl9ala, star,17β-hsd3, era, cyplal, ugtla和gstp1基因的影响,并且和11-KT和E2两个类固醇激素显著相关。通过上述试验研究,结果表明三唑锡对斑马鱼性腺发育及繁殖具有明显的抑制作用,并对类固醇激素合成、转化和代谢通路产生明显干扰作用,表现出斑马鱼性腺轴相关基因调控所对应的抗雌激素效应,其分子机制主要通过以下途径表现出斑马鱼生殖内分泌干扰作用：(1)三唑锡可能通过阻止E2与受体er的结合,导致雌鱼体内E2水平的降低和肝脏vtg表达下调；(2)三唑锡可能通过对斑马鱼类固醇激素P4合成,以及P4转化为DHEA、AE、T和11-KT过程中的相关催化酶3β-hsd、cyp17和17β-hsd3的激活效应,导致了体内雄性激素水平的上升和积累,表现出与E2下降、vtg基因表达下调相同的效应,即抗雌激素干扰效应；(3)由于三唑锡对斑马鱼肝脏的氧化胁迫和甲基化作用影响,促使活性氧自由基的产生及脂质过氧化过程诱导了ugtla和gstp1基因表达的上调,加速了体内类固醇激素的羟基化和甲基化代谢过程；(4)lhβ基因表达的下调可导致血清中促黄体激素浓度的降低,而延迟了精子细胞和卵母细胞的成熟；而E2水平的下降对雌鱼性腺发育具有明显的抑制作用。性腺切片证实E2水平下调导致了生殖损伤的产生。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X171.5

【参考文献】