高比活多聚半乳糖醛酸酶PG8fn结构与功能关系的研究

发布时间：2018-02-11 09:25

  本文关键词： 多聚半乳糖醛酸酶 热稳定性 T3 loop区 催化效率 分子动力学模拟　出处：《中国农业科学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：果胶是一种带负电荷的复杂高分子量多糖,主要存在于陆生植物的细胞壁中,占植物干重的三分之一。它主要由不同甲酯化程度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键共价连接而成。由于果胶多糖的复杂性,其降解需要多种果胶酶共同作用,包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶等。果胶酶广泛应用于果汁、造纸、纺织工业以及油脂的提取工业。其中,研究最多、应用最广泛的果胶酶是多聚半乳糖醛酸酶。因此,探究多聚半乳糖醛酸酶结构与功能之间的关系对于揭示其催化机理是非常重要的。本论文从嗜热真菌Achaetomium sp.Xz8中克隆了一个内切多聚半乳糖醛酸酶的编码基因PG8fn,并在毕赤酵母中实现异源表达。与其他同类酶相比,重组PG8fn的高比活尤其突出:以多聚半乳糖醛酸为底物时的比活高达28,122 U/mg,是研究多聚半乳糖醛酸酶分子催化机制的理想材料。将PG8fn的晶体结构进行解析,本文主要对其结构与功能关系展开研究。基于理性设计的思路探索在酶活不损失的前提下提高酶热稳定性的方法;通过系统研究活性T3 loop区上底物结合位点、二级结合位点和非活性位点对酶催化效率的影响,揭示活性loop区在酶催化过程中的作用;以PG8fn T3 loop区的结构特征指导同类酶分子改良。基于蛋白表面电荷分布优化的理性设计方法对PG8fn进行热稳定性改良。通过酶热稳定性系统(ETSS)的计算结果,确定了可能与热稳定性相关的两个位点Asp267和Asp322。构建单点突变体(D267A和D322R)和组合突变体(D267A/D322R)进行表达和性质测定,并与野生酶PG8fn进行比较。三个突变体的热稳定性都有所提高,提高幅度为D267A/D322RD322RD267A。组合突变体D267A/D322R较野生酶PG8fn的Tmax、T50和Tm值分别提高了10°C、17°C和10.2°C,在50°C和55°C下半衰期分别延长8.4 h和45 min,而其催化活力与野生酶保持在相当的水平(23,000±130 U/mg和28,000±293 U/mg)。分子动力学模拟结果显示突变位点Asp267和Asp322可以降低蛋白整体的RMSD值从而导致刚性增强。此研究结果揭示了表面电荷对蛋白构象稳定的重要性,并为蛋白质热稳定性改造提供了一个极为有效的策略。该方法最突出的特点为提高酶热稳定性的同时不影响酶的催化活性。结构分析显示PG8fn的活性T3 loop区上保守残基Asn117与底物形成氢键,本试验探究了该残基对酶催化效率的影响。分子动力学模拟分析表明虚拟突变体N117A缺失了117位残基与底物+1位GalpA O3原子之间的氢键而使得底物与活性中心分离,而虚拟突变体N117Q具有更长的氨基酸侧链,导致酶与底物错误结合而导致底物逐渐远离活性中心。定点突变试验结果与计算机模拟结果一致,即该位点对其他氨基酸特别敏感。除了Km值从野生酶PG8fn的0.32增加到0.75 4.74 mg/mL外,所有突变体的kcat下降了3 20,000倍,催化效率下降了8 187,500倍,从而导致△(△G)增加了5.92 33.47 kJ/mol。本试验验证了GH28多聚半乳糖醛酸酶活性T3 loop区通过残基Asn117参与了酶的催化过程,该保守残基Asn117对底物的正确定位使其靠近催化残基具有重要的作用。PG8fn与已报道晶体结构的Colletotrichum lupini多聚半乳糖醛酸酶CluPG1(PDB:2IQ7)序列一致性为79.6%,但比活差异一倍。通过结构比对发现两个酶催化口袋里的氨基酸高度相似,只有三个氨基酸残基差异,其中两个分别位于远离催化位点的N末端和C末端,另外一个在PG8fn T3 loop区上的残基Lys121,对应CluPG1的Thr。将CluPG1上Thr121突变成Lys后,突变体T121K与底物亲和力增大,比活提高到了22,300 U/mg,几乎达到了PG8fn的水平,因此残基Lys121是决定PG8fn具有高比活的关键位点。我们对其进行饱和突变研究,各突变体的Km值和kcat值差异显著,其中,突变体K121F和K121W的Km值较野生酶PG8fn降低,催化效率较野生酶PG8fn分别提高了44%和105%。分子动力学模拟结果显示,位于T3 loop区上的第121位残基不仅影响了酶与底物的结合模式,还直接与底物的-4位GalpA相互作用,属于多聚半乳糖醛酸酶的底物二级结合位点。此研究揭示了PG8fn较同类酶比活高的其中一个原因是活性T3 loop区上存在底物二级结合位点。在确定了活性T3 loop区对酶催化效率的重要影响后,进一步研究了T3 loop区上非活性位点在催化过程中的作用。根据PG8fn中独特氨基酸组份分析以及静态结构的通道识别,确定了位于T3 loop区上靠近通道T1的残基Thr113作为定点突变位点。突变试验结果显示各个酶催化效率从大到小的顺序与113位点的氨基酸侧链性质相关,即带正电荷氨基酸(Arg、Lys)极性氨基酸(Ser、Gln、Thr)非极性氨基酸(Gly、Ala、Ile)带负电荷氨基酸(Glu)。通道分析显示突变体T113R较野生酶PG8fn通道T2和T3的占据率和优先权更高。分子动力学模拟结果表明突变体T113R T3loop区由于盐键的断裂而导致柔性增加,继而影响了酶与底物的结合。除此之外,残基Arg113对催化效率的影响在另一个多聚半乳糖醛酸酶PG63上得到验证。此研究证实了活性T3 loop区上的非活性位点可通过改变loop区柔性变化而影响酶催化效率,PG8fn较同类酶比活高的第二个原因是活性T3 loop区上存在极性氨基酸的非活性位点。基于PG8fn T3 loop区上成对的阳离子-π相互作用力这一结构特征,指导PG63进行分子改良,并系统研究了阳离子-π相互作用力影响催化效率的分子机理。通过对PG63序列和结构分析结合分子动力学模拟轨迹的阳离子-π相互作用力占有率计算结果,确定8个可能在PG63中形成阳离子-π相互作用力的位点。其中,引入成对的阳离子-π相互作用力的突变体H58Y较野生酶PG63的催化效率和Tm值分别提高144倍和3.9°C。分子动力学模拟结果表明位于突变体H58Y T3loop区上成对的阳离子-π相互作用力(Arg89-Trp90/Arg89-Tyr58)增加了邻近的T3 loop2上保守残基His158的刚性,从而很好的指引长链寡糖不断的向催化口袋里传送,增加反应速率和转换数,从而提高催化效率。此研究证实了活性T3 loop区上成对的阳离子-π相互作用力可通过增加邻近loop区上保守残基His158的刚性而影响酶催化效率,同时,也从侧面证实了PG8fn较同类酶比活高的第三个原因是活性T3 loop区上存在成对的阳离子-π相互作用力。本论文以高比活多聚半乳糖醛酸酶PG8fn为研究对象,通过对蛋白表面电荷分布的优化,在酶活无损失的前提下有效提高了PG8fn的热稳定性,为酶热稳定性改造提供了一种有效策略;系统研究了活性T3 loop区上底物结合位点、二级结合位点、非活性位点和阳离子-π相互作用力对酶催化效率的影响,揭示了PG8fn具有高比活的分子机制,为活性loop区在酶催化反应过程中的功能研究提供了新的视角,具有重要的科学意义和应用价值。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55
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本文编号：1502723