Pif1解旋酶解旋G4 DNA分子机制的研究

发布时间：2018-02-12 04:56

  本文关键词： Pif1解旋酶 G4 DNA 快速停留荧光检测技术 单分子荧光能量共振转移技术 荧光偏振检测技术　出处：《西北农林科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鸟苷酸-四联体结构(G-quadruplex DNA,简称G4 DNA)是一种富含鸟苷酸(G)序列的四链形态的DNA二级结构,它在胞体内可以发挥各种各样的功能,如维持端粒稳定,参与DNA复制起始调控等。如果解旋G4结构失败,则会影响细胞内DNA的正常代谢,导致基因组的不稳定。生物体内同时进化出解链G4结构的解旋酶;其中Pif1解旋酶被证实在体内与体外实验中都具有很强的解旋G4 DNA的活性。近年来,越来越多的研究主要在酵母的Sc Pif1与人类的hPif1解旋酶的生理生化特征与遗传学方面展开。但是原核生物Pif1解旋酶的潜在功能和生化特性到目前为止仍然不清楚;ScPif1解旋酶与G4 DNA反应的动力学机理也尚不明确;而且Pif1蛋白在单分子水平上如何解旋G4结构也是一项亟待解旋的重要课题。本文针对以上问题,分别从以下三个方面展开相关研究:利用拟杆菌Pif1解旋酶(BsPif1)进行原核生物Pif1蛋白的生化特征与动力学机理的研究;同时,采用快速停留荧光技术监测重组ScPif1解旋酶解旋含G4结构DNA底物的反应动力学过程。此外,使用单分子能量共振转移检测技术研究Pif1解旋酶催化G4结构解旋反应的分子机制。这些研究旨在阐明Pif1解旋酶解旋G4 DNA的动力学特征与分子机制,为深入解析Pif1解旋酶的生理功能提供理论依据。主要研究成果如下:1,首次系统研究原核生物Pif1解旋酶——BsPif1的生化特征与解旋动力学机理。研究结果显示:1)BsPif1解旋酶以单体形式存在并发挥功能。2)BsPif1也具有Pif1家族解旋酶的许多共性。3)作为原核生物Pif1解旋酶的代表,BsPif1在解旋底物特异性等多方面与真核生物ScPif1解旋酶之间存在较大差异。4)BsPif1蛋白可以顺利解旋G4DNA底物,并具有独特的动力学机理。这些结果说明,Bs Pif1蛋白可以有效的解决在DNA代谢过程中出现的各类问题,暗示出该解旋酶可能参与许多重要生理功能。此外,BsPif1在底物特异性与解旋行为模式等方面,都不同于酵母Pif1,而是更类似于人类Pif1解旋酶。2,在研究ScPif1解旋酶解旋G4 DNA底物的动力学过程中首次发现G4 DNA可以极大的增强Pif1蛋白解旋G4结构后双链DNA活性的现象。研究结果显示:1)ScPif1蛋白可以高效地解旋含G4结构的双链DNA,并证实该反应依赖ATP供能。2)G4结构极大地激活Pif1蛋白解旋双链DNA的活性,并且该现象具有其自身结构特点;而G3结构却不能激活Pif1蛋白。3)这种激活效应通过增强解旋速率,解旋步长及解旋持续性等动力学参数表现出来的。4)该激活现象源于G4结构诱导Pif1蛋白二聚化。这些反映出G4 DNA对Pif1蛋白快速解救处于停滞状态的滞后链具有着重要调控作用。3,利用单分子荧光能量共振转移技术,首次明确Pif1蛋白解旋G4结构的单分子反应过程。研究结果表明:1)ScPif1在单个G4 DNA分子上反复徘徊,可以重复将G4结构打开。2)Pif1蛋白解旋单个G4 DNA分子是依顺序性分两步完成的;G-三联体结构在上述G4往复解旋过程中扮演重要的中间体角色。3)根据以上解旋步骤提出Pif1蛋白解旋G4 DNA的分子机制模型。这些结果不仅揭示Pif1蛋白如何解旋G4 DNA而且还为G4结构解旋后与自发再折叠的往复过程提供大量细节。这种新型的往复穿梭解旋机制意味着Pif1蛋白可以有效解旋那些反复形成的G4结构,为DNA聚合酶顺利通过被G4停滞的复制叉提供机会。综上所述,本论文综合运用快速停留荧光检测,单分子荧光能量共振转移技术等新颖的分析技术,系统地研究Pif1解旋酶解旋G4 DNA的动力学特征与单分子机制。这些研究为解旋酶与特定DNA底物作用机理的研究提供经验指导,为理解Pif1解旋酶结构与功能相互关系提供新的理论依据。
[Abstract]:In this paper , we study the biochemical characteristics and mechanism of Pif1 helicase in vitro . This paper presents a molecular mechanism model of Pif1 protein hydrolysis G4 DNA by means of single molecule fluorescence energy resonance transfer technique .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q75

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本文编号：1504827