家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa的鉴定及其在BmNPV入侵中的功能研究

发布时间：2018-03-02 03:30

  本文关键词： 家蚕 BmREEPa 胆固醇 BmNPV 侵染　出处：《西南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：杆状病毒是一类有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,其基因组大小为80-180 kb,以节肢动物为其专一宿主,被广泛的用作昆虫杀虫剂,同时也被用作基因治疗的转移载体和真核表达载体。杆状病毒隶属Baculoviridae,根据其不同的形态学特征可将其划分为核型多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV)两类;根据其对宿主的特异性又可划分为Alpha杆状病毒、Beta杆状病毒、Gamma杆状病和Delta杆状病毒四类。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一类典型的NPV病毒,它所引起的核型多角体病(血液型脓病)对养蚕业的危害极其严重,其造成的经济损失占整个蚕病损失的70%左右,严重影响了蚕丝的产量和质量,减少了蚕农的收入,威胁了我国蚕丝业的稳定和在国际市场上的主导地位。近年来,随着对BmNPV研究的深入,部分与BmNPV抗性相关的家蚕基因被鉴定出来,但是BmNPV的入侵机制始终未能解析清楚。本实验室建立并保存了两株来源于同一品种家蚕幼虫卵巢组织,但对BmNPV感染的敏感性存在显著差异的细胞系—BmN-SWU1和BmN-SWU2,其中BmN-SWU1细胞对BmNPV的感染极其敏感,而BmN-SWU2对BmNPV具有明显的抗性。在前期关于两株细胞系的差异研究中,发现BmN-SWU1和BmN-SWU2细胞系对BmNPV感染敏感性的差异主要是BmNPV入侵BmN-SWU2细胞的过程受到限制。本研究通过iTRAQ蛋白定量技术对BmN-SWU1和BmN-SWU2两株细胞系的蛋白质组差异进行了比较分析,筛选差异的膜蛋白特别是与受体功能相关的膜蛋白,期望通过对这些膜蛋白的研究来解释造成这一差异的主要原因,为阐明BmNPV入侵的详细过程奠定基础,也为从源头控制BmNPV的感染提供理论依据。主要的研究成果如下:1.BmN-SWU1和BmN-SWU2两株细胞系的蛋白质组差异分析本部分通过iTRAQ蛋白定量技术对两株细胞系进行了蛋白质组分析,通过质谱分析鉴定到18952个肽段,匹配到的蛋白质数量为3955个,并对所有鉴定出的蛋白进行go功能注释分析。然后以bmn-swu2为对照对bmn-swu1和bmn-swu2两个样品的的蛋白质丰度进行比较,共检测到629个差异蛋白,其中348个上调蛋白,281个下调蛋白。对这些差异表达的蛋白进一步筛选得到4个膜蛋白,对筛选到的膜蛋白进行深入的分析,鉴定到一个差异倍数大于5,且可能具有增强膜上受体功能作用的膜蛋白——bgibmga013777。荧光定量pcr检测的结果也证实该基因在bmn-swu2中的表达量远低于其在bmn-swu1中的表达量,由此我们将该蛋白锁定为目的蛋白。2.bmreepa基因的鉴定及定位分析受体表达增强蛋白(reep)是一类与细胞表面受体功能有关并且参与跨膜转运的蛋白,这一家族在不同物种之间高度保守。reep家族成员均包含一个tb2/dp1,hva22结构域及2-3个跨膜结构域。在脊椎动物中reep家族一般存在5-6个成员分别命名为reep1-reep6,并且被划分成两个亚家族reep1-reep4和reep5-reep6,而无脊椎动物中reep家族的成员一般为2个。本部分通过对bmreepa基因的序列分析发现该基因含有reep基因保守的tb2/dp1,hva22结构域和三个跨膜结构域;系统发生分析显示bmreepa聚类在reep5-reep6亚家族中。通过免疫荧光和westernblotting分析发现该基因定位于细胞质膜上且其n-末端伸向细胞外而c-末端面向细胞质;通过对该基因的表达模式分析发现其在家蚕五龄三天幼虫的中肠中和化蛹第一天时表达量最高,这一结果暗示该基因可能与脂类物质的代谢或运输相关。3.bmreepa基因对bmnpv入侵的影响本部分通过在敏感细胞系bmn-swu1和抗性细胞系bmn-swu2中分别干涉和过表达bmreepa基因,探索细胞水平bmreepa基因对bmnpv入侵的影响,结果显示:在bmn-swu1中干涉bmreepa可以明显的抑制bmnpv对bmn-swu1细胞的感染;在bmn-swu2中过表达bmreepa可以一定程度上解除bmn-swu2对bmnpv入侵的抑制作用;同时bmreepa可以与bmnpv入侵的关键囊膜蛋白gp64发生相互作用。利用显微注射技术创制了bmreepa干涉的家蚕品系,通过注射和口服感染两种方式使转基因品系和非转基因品系家蚕幼虫感染bmnpv,然后通过致死率分析及病毒基因表达分析来验证该基因在个体水平对bmnpv感染的影响,结果发现bmreepa干涉的家蚕品系中bmnpv的感染能力相比于非转基因家蚕品系被明显的抑制,且这种抑制主要存在于二次感染的过程中,即bv粒子对其它组织的感染。4.bmreepa相互作用蛋白鉴定本部分以bmreepa蛋白为诱饵蛋白通过免疫共沉淀的方法对bmreepa的相互作用蛋白进行了筛选,鉴定到一个具有受体特性且与胆固醇运输相关的蛋白bmptchd;通过进一步的验证发现BmREEPa、BmPtchd以及GP64可以形成一个蛋白复合体。通过研究BmREEPa和BmPtchd基因与胆固醇之间的关系发现,当细胞胆固醇升高时,BmREEPa和BmPtchd基因的表达量均上调,而当细胞胆固醇被移除时BmPtchd基因的表达量下调,而BmREEPa的表达量依旧上调。由此推测:BmREEPa可能在胆固醇代谢运输以及合成过程中都发挥作用,而BmPtchd基因可能仅在胆固醇代谢运输中发挥作用。本研究的结果表明,BmREEPa定位于细胞质膜上,且其N-末端对其定位具有重要的作用;该基因不论在细胞水平还是个体水平都对BmNPV的入侵具有影响,且这种影响主要针对于BV的感染;同时还发现该基因与细胞胆固醇的调节也有密不可分的关系,而胆固醇又是BmNPV入侵不可缺失的因子。综上所述,BmREEPa在整个BmNPV入侵的过程中发挥了重要的作用,此结果不仅为阐明BmNPV入侵的详细机制奠定了基础,同时也为REEP基因的研究提供了一个新的方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 蔡克亚;陈克平;刘晓勇;姚勤;李军;;家蚕抗BmNPV品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差异分析[J];生物工程学报;2008年02期

2 杨金宏;王代钢;卢从德;孔卫青;;BmNPV DNA解旋酶基因酵母双杂交诱饵载体的构建[J];山东农业大学学报(自然科学版);2010年02期

3 ;Immobilization of foreign protein into polyhedra of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2012年02期

4 蔡克亚;陈克平;刘晓勇;姚勤;李军;;二维电泳和质谱技术鉴定BmNPV包埋型病毒粒子的蛋白组成[J];中国农业科学;2008年07期

5 王晓强;冯伟;谢洪霞;周围;张冉;高红;万永继;;柘叶饲养对家蚕消化液中抗核多角体病毒(BmNPV)相关蛋白活性的影响[J];昆虫学报;2011年04期

6 邓继先,王少飞,杨琴,程萱,李琳;用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素[J];生物工程学报;1995年02期

7 吴金美,Robert WLim,吴祥甫,Grace Y Sun,吕鸿声;BmNPV-ZJ iap1基因的克隆、序列分析及其对哺乳动物细胞NF-κB的调节作用研究(英文)[J];蚕业科学;2003年04期

8 徐颖,朱成钢,金勇丰,张耀洲;dsRNA对家蚕核多角体病毒(BmNPV)复制的抑制作用[J];科学通报;2004年11期

9 吴小锋,曹翠平,许雅香,鲁兴萌;BmNPV和AcNPV扩大寄主域杂交重组病毒表达载体的构建和改进[J];中国科学(C辑:生命科学);2004年02期

10 邓继先,王少飞,杨琴,卢建申,程萱,李琳,周耐明,肖成祖;用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素[J];生物技术通讯;1994年03期

相关会议论文 前10条

1 ;A Cationic Detergent Enhancing the Replication of Baculovirus and the Activity of BmNPV ie-1 Promoter In vivo and In vitro[A];中国蚕学会第三届青年学术研讨会暨浙江省第二届青年学术论坛——蚕桑分论坛论文集（上册）[C];2001年

2 潘敏慧;吕军;鲁成;;BmNPV的双基因干涉对病毒增殖的影响[A];中国蚕学会第八届暨国家蚕桑产业技术体系家（柞）蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2011年

3 崔颖俊;吴立娜;赵巧玲;裘智勇;沈兴家;唐顺明;郭锡杰;;家蚕幼虫感染BmNPV后血淋巴蛋白质组学分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（2）[C];2009年

4 吴小锋;;家蚕BmNPV的分子生物学研究进展[A];中国蚕学会第七届二次理事会暨学术年会论文集[C];2005年

5 Jun Zhang;Xue-Mei Chen;Chun-Dong Zhang;Qian He;Zhan-Qi Dong;Xiu-Xiu Kuang;Ming-Ya Cao;Xiao-long Dong;Cheng Lu;Min-Hui Pan;;Different susceptibility to BmNPV of two silkworm ovary cell lines were determined by virus's ability to enter cells[A];第十届家（柞）蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2013年

6 徐安英;林昌麒;钱荷英;孙平江;张月华;刘明珠;李龙;;家蚕抗BmNPV新品种简介[A];第十届家（柞）蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2013年

7 吴福泉;杨琼;肖阳;陈列辉;刘新涛;邢东旭;罗国庆;唐翠明;王振江;;累代添食BmNPV的选拔效果初报[A];华东·华中地区第十二次蚕种学术研讨会论文集[C];2010年

8 王娜;唐顺明;裘智勇;丁丽平;赵巧玲;沈兴家;;感染BmNPV家蚕幼虫马氏管蛋白质组的初探[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（2）[C];2009年

9 孙京臣;金丰良;徐兴耀;谭佩婵;;家蚕核型多角体病毒形态及生物学特性研究[A];中国蚕学会第七次全国代表大会论文集[C];2003年

10 吴金美;R.W.Lim;吴祥甫;Grace Sun;吕鸿声;;家蚕核多角体病毒iap基因的克隆、序列分析及其对哺乳动物细胞核因子-κB的调节作用的研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年

相关博士学位论文 前10条

1 王国宝;家蚕脑的蛋白质组学分析及杆状病毒诱导家蚕行为变化的分子机制研究[D];浙江大学;2015年

2 董小龙;家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa的鉴定及其在BmNPV入侵中的功能研究[D];西南大学;2016年

3 周阳;家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因[D];江苏大学;2010年

4 薛仁宇;表达dsRNA的转基因家蚕对BmNPV的抗性研究[D];苏州大学;2009年

5 杨章女;BmNPV ORF9和ORF56基因功能分析[D];浙江大学;2008年

6 郝碧芳;家蚕核多角体病毒（BmNPV）orf126基因的功能研究[D];西北农林科技大学;2008年

7 徐海君;BmNPV三个杆状病毒核心基因分析[D];浙江大学;2006年

8 相兴伟;家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究[D];浙江大学;2013年

9 梁湘;家蚕核型多角体病毒分子流行病学调查及宿主特异性研究[D];广西大学;2012年

10 沈兴家;BmNPV和AcMNPV egt 基因启动子特性及家蚕海藻糖酶基因启动子活性的滞育激素调节研究[D];中国农业科学院;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 李兵;野桑蚕体内分离的NPV和BmNPV的比较研究[D];苏州大学;2003年

2 王婷婷;两株对BmNPV侵染差异的家蚕细胞系的全基因组表达谱分析[D];西南大学;2012年

3 王四妹;BmCPV、BmNPV入侵的分子机制初步研究[D];苏州大学;2015年

4 潘彩霞;家蚕BmGBP基因的鉴定及其对BmNPV复制的影响[D];西南大学;2015年

5 夏丹丹;家蚕肠粘蛋白基因的鉴定及功能分析[D];西南大学;2015年

6 付绪亮;家蚕类泛素化修饰蛋白的鉴定及BmNPV早期蛋白PE38与宿主互作蛋白的研究[D];江苏科技大学;2015年

7 程晨;BmNPV-pif-1的序列分析及亚细胞定位分析[D];江苏科技大学;2015年

8 张蕾;家蚕接种BmNPV后体内两种代谢酶活性变化及家蚕血淋巴金属蛋白的初步分离检测[D];江苏科技大学;2015年

9 张曦;BmNPV Orf98a和Orf99基因的功能及与p74基因重叠sORF的确认[D];苏州大学;2015年

10 陶柳性;BmNPV感染导致的聚集物（体）的研究[D];江苏大学;2015年

，

本文编号：1554852