转录因子Isl1与互作蛋白PIASy在胰岛素调节中的功能与机理研究

发布时间：2018-03-03 20:13

  本文选题：Isl1　切入点：PIASy　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：蛋白之间的相互作用在生物的各种功能调节中起重要作用。已有的研究结果表明,LIM同源域蛋白家族转录因子Isl1(insulin gene enhancer binding protein 1)可以调控胰岛素的基因表达和激素分泌,但是否存在其他蛋白与Isl1共同发挥作用尚不清楚。本文主要通过构建酵母双杂交Isl1诱饵质粒和睾丸cDNA文库,筛选Isl1的互作蛋白,并且以小鼠胰岛原代细胞和β细胞系NIT细胞为对象,比较系统地研究了转录因子Isl1和互作蛋白PIASy(protein inhibitor of activated STAT 4)对胰岛素合成与分泌的调节功能和相关机理。取得的主要研究结果包括:1.构建了 Isl1诱饵质粒,并针对Isl1的转录激活域进行了改造。结果显示经过改造的诱饵质粒去除了 Isl1自身的自激活活性,可以用作蛋白筛选。构建了酵母双杂交睾丸cDNA文库。经过检测文库滴度达到5.0×107 cfu/mL。2.通过酵母双杂交,钓出了四个Isl1的互作蛋白。它们分别是蛋白PIASy(protein inhibitor of activated STAT 4)、Aip(aryl-hydrocarbon receptor-interacting protein)、Mypop(myb-related transcription factor,partner of profilin)和 Sap 18(sin3-associated polypeptide 18)。3.通过酵母共转实验以及蛋白质免疫共沉淀技术,验证了 Isl1和PIASy蛋白之间的相互作用。免疫荧光双染结果显示Isl1和PIASy共同定位在胰岛β细胞和NIT细胞。4.在体外培养的胰岛原代细胞和NIT细胞中超表达Isl1和PIASy后,结果显示胰岛素基因的表达水平和激素分泌显著升高;用siRNA抑制Isl1和PIASy后,胰岛素基因的表达水平和激素分泌下降明显。说明PIASy可以通过蛋白互作的方式协同Isl1调节胰岛素基因的表达水平和激素分泌。检测2型糖尿病小鼠模型db/db小鼠中Isl1与PIASy基因表达结果显示,Isl1与PIASy的mRNA表达水平上升,提示二者可能与糖尿病发病相关。5.双荧光素酶报告基因结果显示,当Isl1和PIASy均超表达时,胰岛素基因的转录激活活性明显提高,并且高于Isl1或PIASy单独存在时胰岛素基因的转录激活活性。说明PIASy与Isl1通过共同调节胰岛素基因启动子活性实现对胰岛素的调节。6.Isl1突变体去除homeodomain同源域后,胰岛素基因的转录激活活性明显下降;PIASy突变体去除ring结构域后,胰岛素基因的转录激活活性也明显下降,两者对胰岛素启动子的协同调节作用明显下降。结果说明,Isl1的homeodomain同源域和PIASy的ring结构域对于胰岛素启动子的调节十分关键。综上所述,本文研究筛选出了Isl1的四种互作蛋白,并研究了其中一种蛋白PIASy与Isl1在胰岛中的功能及作用机理。PIASy与Isl1通过蛋白互作的方式调节胰岛素基因启动子的活性,进而影响了胰岛素基因的表达水平与激素分泌。这些结果有助于发现调节胰岛素表达的新蛋白因子,并为研究糖尿病中胰岛素异常表达的分子机制提供新的资料。
[Abstract]:The interaction between proteins plays an important role in the regulation of various biological functions. It has been shown that the transcription factor Isl1(insulin gene enhancer binding protein 1 of Lim homologous domain protein family can regulate the gene expression and hormone secretion of insulin. However, it is not clear whether there are other proteins working together with Isl1. In this paper, we constructed yeast two-hybrid Isl1 bait plasmid and testicular cDNA library to screen the interaction proteins of Isl1. The primary mouse islet cells and 尾 -cell line NIT cells were used as subjects. The regulation function and mechanism of insulin synthesis and secretion by transcription factor Isl1 and PIASy(protein inhibitor of activated STAT 4) were studied systematically. The main results obtained include: 1. Construction of Isl1 bait plasmid. The transcriptional activation domain of Isl1 was modified. The results showed that the modified bait plasmid removed the self-activation activity of Isl1 itself. The cDNA library of testis of yeast two-hybrid was constructed. The titer of the library reached 5.0 脳 107cfu-mL.2. by yeast two-hybrid, Four Isl1 interaction proteins were identified. They were PIASy(protein inhibitor of activated STAT 4 Aip-aryl-hydrocarbon receptor-interacting protein, and Sap 18Sin 3-associated polypeptide 18.3.Three proteins were identified by yeast co-transfer test and immunoprecipitation technique. The interaction between Isl1 and PIASy protein was verified. The results of immunofluorescence double staining showed that Isl1 and PIASy were located in 尾 cells and NIT cells of islet. 4. Isl1 and PIASy were overexpressed in primary and NIT cells of pancreatic islets cultured in vitro. The results showed that the expression level of insulin gene and hormone secretion were significantly increased, and Isl1 and PIASy were inhibited by siRNA. The level of insulin gene expression and hormone secretion decreased obviously, which indicated that PIASy could regulate insulin gene expression and hormone secretion in combination with Isl1 through protein interaction. The detection of insulin gene expression and hormone secretion in type 2 diabetic mice db/db mice. The results of Isl1 and PIASy gene expression showed that the mRNA expression level of Isl1 and PIASy increased. The results of double luciferase reporter gene showed that the transcriptional activation activity of insulin gene increased significantly when both Isl1 and PIASy were overexpressed. And the transcriptional activation activity of insulin gene was higher than that of Isl1 or PIASy alone, which indicated that PIASy and Isl1 regulated insulin by co-regulation of insulin gene promoter activity. 6. Isl1 mutant removed homeodomain homologous domain. The transcriptional activation activity of insulin gene decreased significantly after the ring domain was removed by PIASy mutant, and the transcriptional activation activity of insulin gene decreased significantly. The results showed that the homeodomain homologous domain of Isl 1 and the ring domain of PIASy were key to the regulation of insulin promoter. In conclusion, four kinds of interaction proteins of Isl1 were screened. The function and mechanism of one of the proteins PIASy and Isl1 in islets. PIASy and Isl1 regulated the activity of insulin gene promoter by protein interaction. These results may contribute to the discovery of new protein factors regulating insulin expression and provide new information for studying the molecular mechanism of abnormal insulin expression in diabetes mellitus.
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;R587.1

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