1亚基片段中半胱氨酸功能研究

发布时间：2016-10-29 17:24

本文关键词：鼠可溶性鸟苷酸环化酶β_1亚基片段中半胱氨酸功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

鼠可溶性鸟苷酸环化酶β_1亚基片段中半胱氨酸功能研究

刘丽

【摘要】：可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)是含卟啉蛋白，它作为人体内最主要的NO受体，结合NO从而活性提高数百倍，催化GTP生成第二信使cGMP，调节诸多生理功能，比如平滑肌舒张，神经传递，抗血小板凝聚等。sGC是异源二聚体，由α和β两个亚基组成，其中β亚基中结合有一个卟啉。β亚基N末端的194个氨基酸是组成能够结合卟啉的最小片段，与全酶的配基结合性质相似，是H-NOX结构域家族一员。这个结构域经常被当做模型研究sGC的卟啉环境和配基结合特征。一直以来，卟啉一直被认为是NO的唯一结合位点，但最近的研究表明，sGC的半胱氨酸也参与了与NO的反应调节酶的活性。这一发现对了解sGC激活机制，活性调节机制以及相应药物的研发有很重要的意义。在本论文中，我们构建了sGC β1亚基的表达体系，利用大肠杆菌分别表达了鼠可溶性鸟苷酸环化酶的β1亚基，sGC β1(1-385)和sGC β1(1-194)并对相应的蛋白进行了纯化和谱学表征。同时我们将研究的重点放在了蛋白中的半胱氨酸。在sGC β1(1-194)片段蛋白中含有三个半胱氨酸，分别位于78，122和174位，其中78位的半胱氨酸距离卟啉中的铁只有6左右的距离。我们的结果证明β亚基上的78位半胱氨酸（C78）对卟啉的结合稳定性以及酶活都有重要影响。为了研究C78对卟啉稳定性的影响，我们以sGC β1(1-194)为模型，利用分子生物学技术，用带有不同性质侧链的氨基酸对78位半胱氨酸进行了替换得到了关于C78的一系列突变体。利用紫外可见吸收光谱，我们证明了78位氨基酸的极性和长度都不同程度的影响卟啉的稳定性。随着非极性侧链长度的降低(C78M， C78I和C78A)或者极性侧链长度的增加(C78S，C78T，C78E和C78Y)卟啉稳定性下降。同时我们对这一系列突变体的光谱性质进行了研究，发现它们的还原态光谱的差别以及对配基CO结合能力的变化。实验结果表明，当78位半胱氨酸被非极性氨基酸替代时，蛋白的还原态呈现五配位状态，与野生型蛋白相似；当其被极性氨基酸替代时，还原态呈现五，六配位混合态的状态。同时，78位半胱氨酸被极性氨基酸替代时，，突变体对CO的结合能力都表现出不同程度的增强，而被非极性氨基酸替代的突变体则相对减弱。在课题组以往的工作中，曾利用其它同源蛋白对sGC卟啉结合结构域进行了同源模建，在同源模建的基础上我们提出了78位氨基酸影响卟啉稳定性的可能机制。78位极性氨基酸可能通过辅助小分子与卟啉铁的作用影响卟啉的稳定性。另一方面，我们利用sGC β1(1-194)研究了半胱氨酸的亚硝基化。已有报道证明了C78的亚硝基化影响酶的活性。在本论文中我们利用傅里叶红外光谱和定点突变清晰的检测到了sGC β1(1-194)巯基信号并且为发生亚硝基化的位置提供了直接的光谱证据。红外数据显示，sGC β1(1-194)野生型和突变体(C78S和C122S)的巯基信号在2560cm-1左右。由于亚硝基化试剂的加入，巯基信号减弱，证明C78和C122发生了亚硝基化并且这种反应是亚硝基化试剂GSNO浓度依赖的。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

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