犬细小病毒VP2基因的原核表达及鉴定

发布时间：2016-10-29 21:36

  本文关键词：高分辨率熔解曲线（HRM）技术在动物病毒基因分型中的研究及应用，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林农业大学》 2015年

犬细小病毒VP2基因的原核表达及鉴定

张馨颖  

【摘要】：犬细小病毒(CPV)VP2蛋白是CPV的主要结构蛋白,大约占衣壳蛋白的90%,编码病毒主要的抗原决定簇。它既是主要免疫保护性蛋白,又是良好的诊断抗原。因此,VP2基因的表达及鉴定,不仅为建立犬细小病毒血清抗体检测方法提供了诊断抗原材料,也为长春市犬细小病毒流行株的研究提供了资料。本研究以长春某动物医院临床疑似病犬的粪便为样品,根据GenBank中收录的CPV-VP2基因序列设计了一对特异性引物,扩增出大小为1790bp的基因片段。将此片段克隆至pMD18-T载体上,获得重组克隆载体pMD18-T-VP2,经双酶切鉴定及测序,其同源性和遗传进化分析结果表明,此基因片段与GenBank中收录的10个不同国家的CPV-VP2基因的核苷酸同源性为99.2%~99.9%,氨基酸同源性为99.0%~99.8%,由此确定此基因是CPV-VP2基因。其中与一株新CPV-2a型毒株GQ379042.1亲缘性最高,只有一个碱基不同,因此确定该基因属于新CPV-2a型,并申请GenBank登录号KP686093。再将重组克隆载体上的VP2基因亚克隆至原核表达载体pET-32a上,得到的重组表达载体pET-32a-VP2,经双酶切鉴定、PCR鉴定及测序,表明VP2基因已经成功克隆至pET-32a载体上,且阅读框正确,无移码突变。因此,成功构建了原核重组表达载体pET-32a-VP2。将鉴定正确的原核重组表达载体pET-32a-VP2转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞诱导表达。结果表明:在87kD左右出现明显的目的蛋白条带,且以包涵体形式表达;对诱导条件进行优化发现,当IPTG浓度为2mM、诱导时间为4h、诱导温度为37℃时,蛋白的表达量最大;镍柱纯化后,经蛋白免疫印迹试验(Western blotting)鉴定,证明VP2蛋白具有反应原性。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.655
【目录】：

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