小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞诱导分化为类睾丸间质细胞研究
本文选题：小鼠胚胎干细胞 切入点：小鼠成纤维细胞 出处：《暨南大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：雄激素主要由睾丸间质细胞(leydig Cell,LC)合成和分泌的。雄激素缺乏会导致男性外生殖器畸形、第一和第二性征发育迟缓、少精或无精症及性功能障碍等疾病,严重影响人类的生活质量和生殖健康。近年来,由于先天性疾病、环境污染、工作压力日益增大以及人口老龄化等原因导致睾丸间质细胞功能障碍,进而诱发雄激素缺乏相关疾病呈逐年上升的趋势,并已成为当前受到普遍关注的社会问题。尽管临床上可通过补充雄性激素进行替代治疗,但使用者容易出现情绪不稳、肝功能损害、高血脂等并发症及诱发前列腺癌等风险,因而大大限制其广泛应用。为此,本研究利用转录因子诱导胚胎干细胞和成体细胞分化为具雄激素合成分泌功能的类Leydig细胞,为治疗男性雄激素缺乏症提供新方法。在小鼠胚胎干细胞定向分化为类Leydig细胞方面,本研究首先利用小分子化合物8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)和毛猴素(FSK)在体外将过表达类固醇生成因子(SF-1)的小鼠胚胎干细胞(mESC-SF-1)定向诱导分化为未成熟Leydig细胞。然后,再将这些细胞移植至EDS造模“敲除”内源性Leydig细胞的大鼠睾丸内,利用睾丸内环境促进其发育为成熟Leydig细胞。实验结果表明,8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)和毛猴素(FSK)联合使用可以显著提高mESC-SF-1定向分化为Leydig前体细胞的效率,并促进这些前体细胞表达雄激素合成通路中的关键酶(St AR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和INSL3)和合成雄激素。将这些Leydig前体细胞移植至雄激素缺乏的大鼠睾丸内,其能进一步发育为成熟的类Leydig细胞,促进雄激素缺乏大鼠血清睾酮含量恢复到正常水平。为了规避干细胞引起的伦理问题,本研究利用生物信息学分析了参与Leydig细胞谱系发育的转录因子,筛选出11个可能调控成纤维细胞转分化为Leydig细胞的转录因子并克隆至慢病毒载体中。将筛选获得的转录因子分成不同的组合,分别感染稳定表达CYP11A1-promoter-mCherry的胚胎成纤维细胞,再利用流式分析细胞术以及酶联免疫方法分析不同组合诱导CYP11A1阳性表达细胞的比例及其表达雄激素的能力,最后获得最佳诱导成纤维细胞转分化成具雄激素合成功能的类Leydig细胞的转录因子组合Dmrt1、Gata4和Nr5a1(简称DGN)。这3个因子组合可诱导小鼠成纤维细胞转分化为类Leydig细胞,表达Leydig细胞特异蛋白及合成睾酮。将其移植至雄激素低下模型鼠睾丸中,可恢复模型鼠血清睾酮含量至正常水平。转分化前后细胞增殖及表达谱分析结果表明,DGN组合介导的转分化过程并不依赖有丝分裂,而是通过上调甲基化调控基因Gadd45a的表达量进而降低细胞基因组DNA甲基化水平来实现的。此外,DGN组合同样可以诱导终末端分化的成纤维细胞转分化为具雄激素合成功能的类Leydig细胞。本研究利用诱导干细胞定向分化及成体细胞转分化为具雄激素合成分泌功能的类Leydig细胞,为男性不育和性功能低下等生殖系统疾病的药物开发及分子机制研究提供细胞模型和理论基础,促进个体化细胞治疗的进一步发展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
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，本文编号：1603563
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