基于蛋白质组学的四种药用植物蛋白质表达谱、组织特异性及光酶诱导机制研究

发布时间：2018-03-13 01:01

本文选题：蛋白质组学　切入点：金银花　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：药用植物是人类预防和治疗疾病的重要工具,也是新药发现的重要源泉。随着人类更加重视健康,对药用植物的需求越来越大；而野生药用植物资源濒临枯竭,栽培药材质量参差不齐,严重阻碍了中医药的发展,迟滞了创新中药的研究。近年来,申请者所在研究组建立的光酶诱导法通过影响药用植物的代谢途径,显著增加药用植物中有效成分的含量。但由于药用植物资源分布的特异性、基因组信息不完善等因素,导致药用植物中活性成分变化的生物学机制研究仍处于探索阶段。蛋白质组学研究是后基因组时代的热点,是生命特征具体实施的重要环节。本论文基于蛋白质组学技术分别对金银花蛋白质表达谱、阔叶十大功劳组织特异性、长春花和桑叶的光酶诱导机制进行了研究,从蛋白水平初步阐明了四种药用植物活性成分产生或变化的分子机制；同时也为蛋白质组学在药用植物上的应用奠定基础。本论文的主要研究内容和结果如下：(1)应用CPLL技术和PEG分级沉淀法对金银花蛋白质表达谱进行研究。金银花(Lonicera japonica (Thunb.))是一种常见中药,具有抗病毒、抗炎、抗氧化等活性。其主要活性成分为绿原酸、黄酮和环烯醚萜苷类化合物。为了阐明金银花中活性成分产生的分子机制,利用label-free蛋白质组学技术对金银花的蛋白质表达谱进行分析,共鉴定了177个蛋白其中包括6个次生代谢相关蛋白。为了深入挖掘和表征金银花蛋白质表达谱,应用了组合多肽配体库(CPLL)技术对金银花中低丰度蛋白进行富集以及聚乙二醇(PEG)分级沉淀法去除高丰度蛋白,结果经过CPLL处理后共鉴定到614个蛋白包括283个新发现的蛋白,而经PEG处理后共鉴定529个蛋白包括239个新发现的蛋白。这些蛋白大多与氧化戊糖磷酸途径、信号传导、激素代谢和转运相关,结合着两种技术共发现了28个苯丙素、黄酮以及萜类合成途径上的次生代谢相关蛋白。该研究结果为阐明金银花中活性成分的生物合成机制奠定基础。与非药用植物樱花的蛋白质组成比较发现金银花中萜类合成途径中的关键酶—-hydroxymethylbutenyl 4-disphosphate合成酶的丰度是樱花中的十倍,说明在金银花中次生代谢相关蛋白与其活性成分的产生有密切的联系。此外,本文涉及的CPLL技术和PEG分级沉淀法在金银花中的应用为药用植物中低丰度蛋白的研究提供了一种新方法。(2)应用蛋白质组学技术对阔叶十大功劳叶、茎、根三部位特异性进行研究阔叶十大功劳(Mahonia bealei (Fort.))为小檗科十大功劳属常绿植物,现代研究表明,十大功劳具有抗菌消炎、抗病毒及降血压等多种生物活性。其主要活性成分非洲防己碱、药根碱、巴马汀、粉防己碱和小檗碱等生物碱在根中的含量明显高于叶和茎。本文应用蛋白质组学技术对阔叶十大功劳三部位总蛋白进行分析,分别在叶、茎和根中鉴定了304,314和182个蛋白。其中,与生物碱合成途径中的关键蛋白S-adenosylmethionine synthetase和(S)-tetrahydroprotoberberine oxidase仅在根中发现,这可能是根部生物碱含量较高的原因。通过对三部位蛋白质组成的比较,发现十大功劳根中calreticulin蛋白的丰度明显高于叶和茎,这些结果显示具有转运功能的calreticulin蛋白则很可能负责将生物碱等活性成分从根部转运至其他组织部位导致其组织间的差异性。该研究首次在蛋白水平揭示阔叶十大功劳不同部位活性成分含量差异的分子机制。(3)应用蛋白质组学技术研究长春花光酶诱导机制长春花(Catharanthus roseus)为夹竹桃科长春花属植物,全草入药,长春花植株中所含的生物碱具有多种药理活性。申请者所在研究组前期研究发现光酶诱导后长春花叶片中的吲哚类生物碱含量明显增加。为了探索光酶诱导对长春花中吲哚生物碱合成的影响,本文应用了label-free蛋白质组学技术对光酶诱导前后长春花植株叶片总蛋白进行分析比较,结果共鉴定了87个差异蛋白,其中21个表达下调,66个表达上调。此外,光酶诱导后三羧酸循环和细胞壁相关蛋白的丰度显著升高,而四吡咯合成以及光合作用相关蛋白的丰度降低。其中光酶诱导后吲哚生物碱生物合成途径中的关键酶10-hydroxygeraniol oxidoreductase (10-hgo)的丰度是对照组中的两倍。结合荧光定量PCR技术对光酶诱导期间长春花叶片中包括10hgo基因在内的吲哚生物碱合成途径上关键基因进行表达分析验证,结果表明光酶诱导显著影响长春花植株的光合作用,而其通过提高体内生物碱的合成来适应光酶诱导。该研究阐明了长春花植株中活性成分生物碱含量增加的分子机制,为光酶诱导法的运用提供了理论依据。(4)应用蛋白质组学技术研究光酶诱导桑叶中Diels-Alder加合物生物合成机制桑(Morus alba L.)是重要的药食同源药用植物,其干燥的根皮中含有微量具有抗炎、抗肿瘤和抗病毒等生物活性的Diels-Alder型加合物。本文利用光酶诱导法诱导新鲜桑叶产生大量Diels-Alder型加合物及其前体物,并对该类化合物进行分离、结构鉴定以及定量分析,共从光酶诱导的桑叶中分离得到9个化合物：绿原酸、异槲皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、桑辛素M、桑辛素C、桑辛素N、Morachalcone、Chalcomoracin和Guangsangon E。此外,分别对对照组、UV-B组、UV-B联合暗培养组桑叶进行差异蛋白质组学分析,结果在UV-B组中共鉴定了123个差异蛋白,其中107个表达上调,16个表达下调；而UV-B联合暗培养组中共鉴定了169个差异蛋白,其中40个表达上调,129个表达下调。通过对Diels-Alder加合物合成途径中关键基因的表达分析以及Diels-Alder合酶的酶活验证,首次揭示了光酶诱导桑叶中Diels-Alder型加合物生物合成的机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q946

【参考文献】