多粘类芽孢杆菌SC2形态分化的分子机制研究

发布时间：2018-03-20 05:08

  本文选题：多粘类芽孢杆菌　切入点：基因组重测序　出处：《山东农业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是杆状、产芽孢的革兰氏阳性细菌,多分离自植物根际土壤。近年来,由于其显著的植物促生功效和抑菌效果,被普遍认为是一种植物根际促生菌(plant-growth-promoting rhizobacteria,PGPR)。多粘类芽孢杆菌能产生多种抑制细菌和真菌生长的拮抗物质,如多粘菌素(polymyxin)、环杆菌素(circulin)、乔利肽菌素(jolipeptin)、多肽菌素(polypeptins)、谷缬菌素(gatavalin)和杀镰孢菌素(fusaricidins)等多种抗生素,而且由于某些抗生素的合成方式属于非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases,NRPS)合成的,这更加吸引了越来越多的研究者关注。本实验室在前期工作中分离出一株多粘类芽孢杆菌,命名为SC2。该菌株对多种植物病原真菌和细菌均有显著抑菌效果。然而,在实验室培养环境下,SC2菌株的菌落形态表现出了极大的不稳定性。研究发现,SC2-M1和SC2-M2是分离自SC2连续培养过程中的两个自发突变株。与野生株SC2相比,SC2-M1和SC2-M2在形态上存在明显差异,研究发现三者在产孢能力、鞭毛及运动性、菌落形态、多糖合成、拮抗能力、生物膜形成、营养物质利用能力及生长情况等方面均有明显差异。通过基因组重测序和转录组测序的方法,获得了更全面的基因组差异和转录组差异信息。基因组重测序结果显示,与SC2相比,SC2-M1基因组上共发生了14处变异,包括10处SNV,3处Indel和1处SV;SC2-M2基因组上共发生了9处变异,包括7处SNV和2处Indel。对基因编码区内的变异分析发现,直接涉及芽孢形成的基因只有发生在染色体3383926位置处spo0A的632位置GA的单核苷酸突变。该突变导致了Spo0A蛋白的211Arg替换为211His。spo0A是芽孢形成过程中起始阶段的关键调节基因。通过对多种产芽孢菌株中Spo0A蛋白的氨基酸序列比对分析发现,211Arg是高度保守性的,参与了Spo0A蛋白HTH结构域与DNA靶序列的结合作用。对三株菌的转录组测序结果显示,在SC2-M1和SC2-M2中涉及芽孢形成的基因表达水平大幅下调,尤其是受到Spo0A直接调控的spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、sigE和sigF都表现出明显下调;然而,涉及芽孢形成初期的基因,包括spo0A在内的磷酸传递中继系统的基因的表达水平都未显示明显差异。据此推测Spo0A的211Arg替换引起其调控功能失活是导致芽孢形成受阻的关键原因。分别在SC2-M1和SC2-M2中进行了spo0A的功能回补实验。利用自杀质粒介导的DNA同源重组系统将Spo0A突变的211His重新恢复至野生型211Arg;同时,在SC2-M2中又将211His分别替换为211Asp和211Ala,观察重组菌株的芽孢形成情况。结果表明,只有当211位置为Arg时,SC2-M2的产孢能力才得以恢复。本实验不仅证实了多粘类芽孢杆菌SC2菌株产孢能力的丧失是由基因组中spo0A基因632位置发生GA点突变引起的,而且进一步证明了Spo0A蛋白211Arg对其功能的必需性。除spo0A基因的变异直接影响突变株的芽孢形成差异以外,对两突变株上的其他突变进行了分析,找到了有可能影响如鞭毛和运动性、胞外多糖合成、杀镰孢菌素合成水平等方面的关键基因,全面的阐述了突变菌株与野生株的表型差异主要是由于基因组的变异引起的。揭示芽孢形成分子机制不仅是基本的生物学问题,而且对于芽孢杆菌在农业生产中的应用具有十分重要的实践价值。本研究为多粘类芽孢杆菌芽孢形成的生理过程提供了丰富的遗传背景信息,获得的基因组重测序数据和转录组数据对进一步开展多粘类芽孢杆菌SC2菌株的功能基因组学研究奠定了良好基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93

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本文编号：1637636