猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN

发布时间：2016-11-09 14:48

  本文关键词：猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制，，由笔耕文化传播整理发布。

《东北农业大学》 2015年

猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制

胡晓亮  

【摘要】：猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)是引起猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)的病原。临床方面表现为严重脱水、呕吐和水样腹泻,是一种高度接触性和急性传染病。各年龄段的猪对TGEV都易感,特别能够引起两周龄以下的仔猪死亡,致死率为100%。TGE流行范围非常广,发病率和致死率极高,是我国和其他国家仔猪死亡的重要疫病之一,并且给养猪业造成了严重经济损失。本实验从黑龙江省哈尔滨市周边某猪场收集腹泻仔猪的粪便通过TGEV的N基因引物进行RT-PCR鉴定,扩增到一段约1100 bp的基因序列,同时用PRRSV、PEDV和PRV的引物进行特异性实验没有扩增到目的基因,将扩增得到的目的基因与p MD18-T载体连接后进行测序分析,结果表明该基因序列与TGEV核苷酸序列相似性为98.5%,这说明腹泻仔猪的粪便中含有TGEV。将该粪便病料经适当离心,0.22μm过滤后接种PK15细胞。经过盲传8代后细胞出现典型病变,利用透射电镜观察确定该病毒的形态是有囊膜的冠状病毒,直径大小在80~100 nm,将该病毒分离株命名为TGEV-HX株。分别设计10对引物对HX株进行全基因组测序,可以成功拼接成28580 bp,基因组上依次为5’-UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-E-N-ORF7-3’UTR。与国内分离株同源性很高,遗传进化树分析显示HX株与Purdue在同一个进化分支,与疫苗株H165进化关系较远。固有免疫是宿主抵御微生物入侵的第一道防线,主要过程分为干扰素(IFNs)合成通路和IFNs信号通路,IFNs与相应受体结合后激活JAK/STAT途径,进而激活ISGs产生,最终导致抗病毒感染平台产生。本实验通过利用TGEV HX和UV-TGEV HX分不同时间段分别感染PK-15,收集细胞后提取总RNA后,采用q RT-PCR方法检测IFN-α1,IFN-β,IL6,IL12,TNF-α,IRF7,Mx1,ISG56,STAT1和β-actin的转录水平,进而分析TGEV HX与固有免疫细胞因子之间的相互关系。结果发现TGEV HX能够通过其自身复制抑制IFN-α1,IFN-β,TNF-α,IRF7和ISG56的转录,对于IL6,IL12和STAT1转录水平与UV-TGEV相当,而TGEV能够诱导高水平的Mx1基因转录。这说明TGEV利用其自身复制调节细胞因子的转录,进而完成病毒复制和传播。所有冠状病毒都编码木瓜样蛋白酶(PL),负责将病毒早期ORF1合成的多聚蛋白切割开来,是病毒复制必需基因。SARS,NL63,PEDV和MHV中都发现PL蛋白有抑制IFN-β通路的作用,而TGEV也存在PL蛋白,且晶体结构分析表明TGEV PL与SARS PL结构相似,说明存在相似的功能。本实验研究发现TGEV PL蛋白能够抑制IFN-β的合成并且不依赖于其催化活性。PL能够定位于线粒体中不能影响STING形成的二聚体,但是具有去泛素化功能能够将RIG-1和STING蛋白去泛素化阻止向下游信号转导。综上,本实验成功分离TGEV地方流行毒株TGEV HX株,对该病毒的流行病学、实验室诊断和病毒的生物学特征进行研究;TGEV HX能够通过自身复制调节宿主细胞因子的转录从而有利于自身复制;TGEV HX PL能够通过去泛素化功能抑制IFN-β的产生。

【关键词】：
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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