西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克

发布时间：2016-11-12 16:06

  本文关键词：西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克隆、表达与遗传转化研究，由笔耕文化传播整理发布。

《郑州大学》 2015年

西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克隆、表达与遗传转化研究

吕品  

【摘要】：类胡萝卜素为以多个共轭的碳碳双键为生色系骨架的脂肪族或脂环族类型化合物,是由植物和微生物合成的一大类色素,因具有多种医学生物学功能而广受关注。西瓜(Citrullus lanatus)属于大众化水果之一,瓜瓤所具有的红、粉红、黄、白等瓤色是由类胡萝卜素组成与含量的差异所致的,研究西瓜类胡萝卜素生物合成积累代谢,并进行遗传操作,探讨其抗肿瘤作用,可为西瓜类胡萝卜素的开发利用,进行西瓜营养育种和种质创新提供依据。本课题从基因水平上分析西瓜果实类胡萝卜素合成代谢的调控机制,并建立农杆菌介导的西瓜遗传转化体系,试图通过转基因技术对西瓜果实类胡萝卜素的成分进行改良。此外,本课题还对番茄红素和β-胡萝卜素抗肿瘤作用的分子机制进行研究。主要内容如下:利用RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中分离获得牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氢番茄红素合成酶基因PSY的c DNA全长序列,并通过生物信息学方法对其核酸及推导的氨基酸序列进行分析。结果显示,(1)西瓜GGPS基因c DNA序列全长1,445 bp(Gen Bank登录号:KF914758),开放阅读框为1,092 bp,编码363个氨基酸,预测蛋白分子量约39 k Da。西瓜GGPS氨基酸序列与同为葫芦科的甜瓜和黄瓜GGPS的同源性高达96%和95%。预测GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸组成的转运肽信号序列。(2)西瓜PSY基因c DNA序列全长1,561 bp(Gen Bank登录号:KC166870),开放阅读框为1,266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量约47.3 k Da。西瓜PSY氨基酸序列与同为葫芦科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分别高达95%和94%。预测PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸组成的转运肽信号序列,转运肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸为一跨膜螺旋结构。种植四种不同瓤色的西瓜:红瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黄瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”,采摘收集各发育和成熟时期(授粉后6天、12天、18天、24天、30天、36天)的果实样品,利用HPLC法检测类胡萝卜素的组成和含量,通过RT-q PCR技术分析类胡萝卜素代谢相关酶基因(GGPS,PSY,PSY-A,PDS,ZDS,CRTISO,LCYB,CHYB,ZEP,NCED1,NCED2和NCED3)的表达。结果显示,红瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成熟果实中主要含番茄红素,以及少量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、δ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和紫黄质。其中,番茄红素在12 DAP时出现,在此后的发育时期,其含量逐渐增加并成为主要的类胡萝卜素。在18-30 DAP期间,“CN66”中大多数类胡萝卜素合成酶基因(包括GGPS)的表达量大幅增高,而代谢酶基因NCED1和NCED2的表达量较低,导致该时期类胡萝卜素的大量积累;黄瓤“ZXG381”中主要含叶黄素和紫黄质,并且在果实发育和成熟过程中,其二者含量分别与CHYB和ZEP基因的表达量呈正相关;在白瓤“ZXG507”果实发育过程中,始终只能检测到痕量的叶黄素和紫黄质,主要归因于类胡萝卜素合成酶基因(尤其GGPS)的表达量较低,而代谢酶基因NCED1则保持较高的表达量。该结果表明,类胡萝卜素合成代谢相关酶基因的转录调控,对不同瓤色西瓜果实中类胡萝卜素的组成和含量具有十分重要的影响。分别构建由西瓜果实特异性AGPL1启动子驱动类胡萝卜素合成相关酶基因(GGPS,PSY,LCYB)的植物表达载体,并转入根癌农杆菌EHA105中。建立西瓜品种“红一号”的子叶体外再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系,试图将GGPS基因转化西瓜。结果显示,(1)以3 d龄的无菌苗子叶为外植体,接种至不定芽诱导培养基MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.2 mg/L中,获得的诱导率最高;最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L。(2)不定芽诱导阶段的卡那霉素筛选浓度为75 mg/L,生根阶段的筛选浓度为40 mg/L。氨苄青霉素浓度为200 mg/L或头孢霉素浓度为300 mg/L时,对外植体的生长无明显影响,可用于农杆菌侵染后的脱菌和抑菌过程。外植体经预培养2 d,用OD600值0.5的农杆菌EHA105(转入植物表达载体p AGPL1-GGPS)菌液浸染10 min,再共培养3 d,有利于提高遗传转化的效率。经PCR检测,初步证实GGPS基因已经导入西瓜植株,转化频率为1.33‰。利用MTT法检测番茄红素和β-胡萝卜素对人食管鳞癌细胞EC109增殖的影响,通过Western Blotting技术分析上述类胡萝卜素对PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2蛋白表达的影响。结果显示,番茄红素和β-胡萝卜素(5-40μM)均能显著抑制EC109细胞增殖,其抑制程度与处理浓度和时间呈正相关,即呈剂量-时间依赖效应;使用3μM GW9662(PPAR?特异性抑制剂)预处理,能够部分减弱上述类胡萝卜素对细胞的抑制作用;番茄红素和β-胡萝卜素(40μM)均能显著促进PPAR?和p21WAF1/CIP1表达,抑制Cyclin D1和Cox-2表达,而经GW9662预处理,能够显著削弱上述类胡萝卜素引起的PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2的表达变化。该结果表明,番茄红素和β-胡萝卜素能通过PPARγ信号通路调控p21WAF1/CIP1和Cyclin D1的表达,干涉癌细胞周期进程,同时下调Cox-2表达,进而发挥对癌细胞增殖的抑制作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S651;Q943.2
【目录】：

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1 陈克农;朱子成;王欣;栾非时;王学征;;西瓜子叶再生体系的初步建立[J];北方园艺;2010年06期

2 张志忠,吴菁华,吕柳新;根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究[J];果树学报;2005年02期

3 刘丽锋;古勤生;胡京昂;俞正旺;刘君璞;彭斌;李莉;;小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因导入西瓜的遗传转化[J];果树学报;2007年04期

4 钟秋月;国艳梅;梁燕;王孝宣;杜永臣;朱德蔚;高建昌;戴善书;;两个不同来源的番茄GGPS基因克隆和序列分析[J];华北农学报;2009年03期

5 任春梅,董延瑜,洪亚辉,赵燕;西瓜组织培养的研究[J];湖南农业大学学报;2000年01期

6 ;The Arabidopsis Spontaneous Cell Death1 gene, encoding a ζ-carotene desaturase essential for carotenoid biosynthesis, is involved in chloroplast development, photoprotection and retrograde signalling[J];Cell Research;2007年05期

7 阎志红;刘文革;赵胜杰;何楠;;四倍体西瓜子叶植株再生试验[J];中国果树;2007年06期

8 王慧中,赵培洁,周晓云;农杆菌法转化获得转基因西瓜植株[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2000年01期

9 张建成;陶能国;仝铸;邓秀新;;‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达[J];中国农业科学;2008年10期

10 ZHANG Jian-cheng;ZHOU Wen-jing;XU Qiang;TAO Neng-guo;YE Jun-li;GUO Fei;XU Juan;DENG Xiu-xin;;Two Lycopene β-Cyclases Genes from Sweet Orange (Citrus sinensis L. Osbeck) Encode Enzymes With Different Functional Efficiency During the Conversion of Lycopene-to-Provitamin A[J];Journal of Integrative Agriculture;2013年10期

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1 商丽敏;几丁质酶和葡聚糖酶基因对西瓜遗传转化的研究[D];东北农业大学;2012年

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1 肖守华;赵善仓;王崇启;董玉梅;焦自高;;厚皮甜瓜高效再生体系的建立[J];山东农业科学;2007年04期

2 赵彩萍;王荣华;张治平;汪良驹;;西瓜植株再生优化体系的研究[J];安徽农业大学学报;2009年02期

3 熊先军,杨丽梅,刘明月,方智远;蔬菜转基因研究进展[J];北方园艺;2004年01期

4 周辉,赵福宽,林成,高遐虹,程继鸿;分子标记及其在葫芦科作物抗病育种中的应用[J];北方园艺;2005年01期

5 彭炳惠,王秀峰;转基因蔬菜的现状及安全性分析[J];北方园艺;2005年03期

6 李靖;李焕秀;李敏;;‘翠妃’苦瓜子叶不定芽诱导研究[J];北方园艺;2007年10期

7 陈磊;庞晓虹;刘宏宇;;西瓜组织培养及遗传转化的研究进展[J];北方园艺;2009年02期

8 薛丹丹;张凤生;王保菊;李建红;赵娜;武斌;;黄瓜再生体系的建立[J];北方园艺;2010年07期

9 高宁宁;张显;刘娜娜;;西瓜子叶离体再生体系的建立[J];北方园艺;2011年10期

10 刘静;赵强;王旭英;郑晓彬;;西瓜高效离体培养再生植株的研究[J];北方园艺;2012年04期

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1 吴韩英;西瓜果实特异性基因wml1 5'端启动子区转录调控功能及其应用研究[D];浙江大学;2003年

2 杨国慧;滇黑两省南瓜病毒病病原鉴定及其外壳蛋白基因克隆[D];东北农业大学;2003年

3 张志忠;几丁质酶基因和几丁质酶—葡聚糖酶双价基因导入西瓜的研究[D];福建农林大学;2004年

4 侯丽霞;甜瓜自交系再生与遗传转化体系的研究及蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的全长cDNA克隆[D];山东农业大学;2006年

5 肖守华;西瓜、甜瓜遗传转化体系的建立及转基因植株的抗病性分析[D];山东农业大学;2006年

6 夏海武;芪合酶基因的克隆及其对甜瓜的遗传转化[D];福建农林大学;2006年

7 潘志勇;基于组学的甜橙红肉变异分子机理[D];华中农业大学;2011年

8 张小军;‘澳洲青苹’苹果套袋处理后果实着色相关基因的克隆及表达分析[D];西北农林科技大学;2013年

9 门潇;花椰菜和拟南芥中or基因作用机理的分析[D];南京大学;2011年

10 汪淑芬;FRUITFULL调控番茄果实发育与成熟的机理研究[D];华中农业大学;2014年

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1 马乐园;甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆、表达分析及遗传转化[D];山东农业大学;2011年

2 李娟;西瓜离体再生体系的建立及根癌农杆菌介导Pti4基因的遗传转化[D];四川农业大学;2011年

3 李海萍;萝卜带柄子叶离体再生体系的建立及遗传转化[D];西北农林科技大学;2011年

4 高宁宁;银杏抗菌肽基因Gnk2-1转化甜瓜和西瓜的研究[D];西北农林科技大学;2011年

5 张嫔;万寿菊属植物染色体核型分析及万寿菊psy基因遗传转化体系影响因素的研究[D];上海交通大学;2012年

6 郑先波;无籽西瓜愈伤组织诱导及植株再生的研究[D];河南农业大学;2003年

7 石晓云;利用组织培养诱导西瓜四倍体的研究[D];河北农业大学;2003年

8 宋莉英;苦瓜（Momordica charantia L.）离体植株再生体系的建立[D];西南师范大学;2004年

9 胡京昂;小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因介导的对西瓜病毒抗性的研究[D];河南农业大学;2005年

10 李建勇;酵母SAMDC基因转化西瓜的研究[D];浙江大学;2006年

【二级参考文献】

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1 杨秀云;西瓜枯萎病的发生特点及防治措施[J];现代农业科技;2005年08期

2 李小卫;;西瓜枯萎病的综合防治技术[J];现代农业科技;2011年12期

3 张慧军,石跃进,朱永红,王娇娟,岳建雄;棉花转基因工作中利用卡那霉素筛选试管再生株的研究[J];北京农业科学;2001年03期

4 孔庆国,于喜艳;浅谈西瓜育种成就和展望[J];长江蔬菜;2001年08期

5 丁国华,徐仲,朱祥春,史芝文;花粉管通道法导入抗赤星病烤烟总DNA D_1代性状变异的研究[J];东北农业大学学报;2000年02期

6 徐鹏飞;张淑珍;吴俊江;韩英鹏;张大勇;李文滨;杨传平;;利用卡那霉素对花粉管通道法转基因大豆的筛选研究[J];大豆科学;2006年03期

7 陶兴林,黄永红,陆璐,赵长增;2个甜瓜品种高效再生体系的建立[J];西北植物学报;2005年04期

8 孔青,丰震,刘林,孔雨光,张颖;外源DNA导入花粉管通道技术的发展和应用[J];分子植物育种;2005年01期

9 徐娟,邓秀新;柑橘类果实汁胞的红色现象及其呈色色素[J];果树学报;2002年05期

10 柳李旺,陈崇顺,陈锋,赵丽萍;生物技术在西瓜遗传育种研究中的应用[J];果树学报;2004年05期

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1 肖亮;地衣芽孢杆菌MY75几丁质酶特性及表达调控元件的研究[D];南开大学;2010年

2 徐娟;几个柑桔产区果实色泽评价及红肉脐橙（Citrus sinensis L.cv.Cara cara）果肉呈色机理初探[D];华中农业大学;2002年

3 张志忠;几丁质酶基因和几丁质酶—葡聚糖酶双价基因导入西瓜的研究[D];福建农林大学;2004年

4 国艳梅;源于多毛番茄控制果实颜色等性状的QTL定位及相关基因的研究[D];中国农业科学院;2006年

5 刘志勇;热胁迫下番茄多胺代谢与基因差异表达分析[D];中国农业科学院;2007年

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1 李娟;西瓜离体再生体系的建立及根癌农杆菌介导Pti4基因的遗传转化[D];四川农业大学;2011年

2 邹小花;西瓜枯萎病抗性鉴定与遗传规律分析[D];甘肃农业大学;2011年

3 杨成德;农杆菌介导的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因转化黄瓜的方法研究[D];甘肃农业大学;2001年

4 邓小燕;抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究[D];西南农业大学;2003年

5 李爱民;农杆菌介导番茄转CMV-dMP基因研究[D];扬州大学;2004年

6 骞宇;农杆菌介导法将水稻几丁质酶基因导入油菜的研究[D];四川大学;2004年

7 吴瑞;几丁质酶和β-1，，3-葡聚糖酶基因遗传转化柱花草的研究[D];华南热带农业大学;2005年

8 东丽;chi、rip、DREB1A基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化[D];东北农业大学;2005年

9 常尚连;西瓜糖代谢及甜瓜酸性转化酶反义基因的西瓜遗传转化[D];山东农业大学;2006年

10 罗燕华;农杆菌介导的苦瓜遗传转化研究[D];福建农林大学;2006年

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1 李京淑;;许勇 破译西瓜“黑匣子”[J];科技潮;2013年02期

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4 ;中国西瓜博物馆[J];科技潮;2005年07期

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7 高新一;王玉英;;西瓜品种的发展方向[J];植物杂志;1988年05期

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4 马双武;王吉明;尚建立;徐小军;;西瓜对卡那霉素处理的反应研究[A];纪念全国西瓜甜瓜科研与生产协作50周年暨第12次全国西瓜甜瓜学术研讨会论文摘要集[C];2009年

5 孙逊;任瑞星;王蕊;麻翠丽;侯伯生;;唐山三号西瓜新品种的选育[A];纪念全国西瓜甜瓜科研与生产协作50周年暨第12次全国西瓜甜瓜学术研讨会论文摘要集[C];2009年

6 张作刚;郭尚;田永强;;西瓜砧木根系分泌物的化感效应[A];纪念全国西瓜甜瓜科研与生产协作50周年暨第12次全国西瓜甜瓜学术研讨会论文摘要集[C];2009年

7 江海坤;严从生;方凌;王明霞;王艳;董言香;张其安;;西瓜黑皮性状的主基因+多基因遗传分析[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年

8 徐润芳;;美国西瓜抗枯萎病育种进展[A];中国园艺学会成立六十周年纪念暨第六届年会论文集（Ⅱ蔬菜）[C];1989年

9 郑绍儒;朱别房;;西瓜新品种泉鑫一号的选育[A];园艺学文集——湖南省园艺学会第八次会员代表大会暨学术年会论文集[C];2005年

10 顾卫红;宋荣浩;杨红娟;马坤;;抗病、优质、早熟西瓜新种质的创新选育[A];首届长三角园艺论坛论文集[C];2007年

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1 记者　张鹏毅;[N];海南日报;2006年

2 田宏杰;[N];开封日报;2006年

3 记者 夏红尧;[N];烟台日报;2008年

4 冷永新;[N];农民日报;2009年

5 唐红梅　周瑛 祝瑶 赵卿;[N];农民日报;2009年

6 本报记者 王恒真 通讯员 杨文君;[N];中国商报;2001年

7 记者 梁庆华 通讯员 卢荫衔;[N];中国食品报;2009年

8 张广臣;[N];毕节日报;2010年

9 新华;[N];山西科技报;2001年

10 郭雪红;[N];经理日报;2005年

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1 吕品;西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克隆、表达与遗传转化研究[D];郑州大学;2015年

2 吴洪生;西瓜连作土传枯萎病微生物生态学机理及其生物防治[D];南京农业大学;2008年

3 田海清;西瓜品质可见/近红外光谱无损检测技术研究[D];浙江大学;2006年

4 王芳;西瓜压缩及蠕变特性的研究[D];内蒙古农业大学;2008年

5 刘景安;西瓜果实品质形成的生理生化机制与基因表达谱研究[D];中国农业科学院;2013年

6 李敏;AM真菌对西瓜抗枯萎病的效应及其机制[D];中国农业大学;2005年

7 易克;西瓜遗传图谱的构建及其重要农艺性状的基因定位[D];湖南农业大学;2002年

8 吕卫光;上海市郊西瓜连作障碍成因及应用生物有机肥进行防治的研究[D];南京农业大学;2008年

9 徐雪莲;西瓜抗蚜性鉴定及其机理研究[D];海南大学;2013年

10 刘娜;西瓜氮素养分高效吸收利用的机制研究[D];浙江大学;2013年

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1 魏巍;西瓜振动特性及振动对其品质影响研究[D];内蒙古农业大学;2015年

2 李凯;连作与轮作对砂田西瓜土壤微生物学性状及化学性状的影响[D];宁夏大学;2015年

3 袁静贤;生长素相关转录因子家族基因在西瓜果实膨大过程中的调控作用分析[D];华中农业大学;2015年

4 杨炳艳;低温胁迫下不同倍性西瓜基因的差异表达及表观遗传研究[D];河北农业大学;2015年

5 吴宇芬;镧对嫁接西瓜生理指标与产量品质的影响[D];中国农业科学院;2008年

6 王威麟;西瓜病毒病的田间调查及多重RT-PCR同步检测[D];西北农林科技大学;2010年

7 代巧鹰;种用西瓜果肉利用技术研究[D];湖南农业大学;2010年

8 唐海东;嫁接西瓜化感效应的研究[D];四川农业大学;2010年

9 崔艳玲;北京市大兴区西瓜产业化现状研究[D];中国农业科学院;2011年

10 吕飞玲;基于声学特性的西瓜品质无损检测方法研究[D];浙江大学;2003年

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