Ash1L介导神经元活性对neurexin-1α的转录调节

发布时间：2021-04-10 18:40

神经元可塑性主要通过神经元活性对基因表达调节实现。受神经元活性调节的基因包括立即早期基因,如Egr1,Fos和Npas4,常编码转录因子,调节下游基因的转录;也包括一些突触相关基因,如Bdnf,编码脑源性神经营养因子,直接影响神经元存活和突触功能。随着高通量技术的应用,现已鉴定出很多基因表达受神经元活性调节。但对调节过程的分子机理和表观遗传学机制还有待进一步研究。神经元neurexin-1α(Nrxn1α)编码突触前粘黏蛋白,参与突触形成和递质传递。尽管Nrxn1α突变与孤独症谱系障碍和精神分裂症等神经疾病密切相关,目前对其转录调节还缺乏认识。本文以Nrxn1α基因为研究对象,发现短暂的神经元活性刺激能够长时程抑制Nrxn1α基因转录。为了深入探究这一转录调节过程,我们针对Nrxn1α启动子设计了与之特异结合的人工锌指蛋白(GST-ZFP-pnrxn1α)。通过锌指蛋白下拉实验,分离并鉴定出生理状态下Nrxn1α启动子区的结合蛋白。其中,蛋白组蛋白甲基转移酶Ash1L与Nrxn1α启动子结合,介导神经元活性对Nrxn1α转录抑制作用。原代皮层神经元中,短暂的神经元活性刺激能够促使Ash1L在Nrxn1α启动子上富集,增加启动子区H3K36me2修饰,进而抑制Nrxn1α基因转录。而敲除Ash1L的表达,则能够完全解除该抑制作用。小鼠海马体中,Ash1L的表达量高于其它脑区。与WT小鼠相比,Ash1L+/-小鼠海马体中Ash1L表达缺陷,使得Nrxn1α启动子区H3K36me2的修饰减少,Nrxn1α基因的表达量上调,且海马体CA1纹状层的突触密度也显著增加。Ash1L+/-小鼠具备正常的条件性恐惧学习和记忆能力。但是形成记忆的稳定性降低,易受到干扰。在行为上表现为在对不同的环境的区辨能力的下降。本论文研究发现,组蛋白甲基转移酶Ash1L介导了神经元活性对Nrxn1a基因转录的长时程抑制作用,揭示了一个全新的,受神经元活性调节的基因转录抑制过程,为后续研究表观修饰对突触可塑性基因转录调节提供新示例。为深入认识表观遗传学调节在大脑行使正常功能中的作用具有重要的参考意义。
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338

文章目录

摘要

Abstract

第1章前言

1.1 真核生物基因转录激活

1.1.1 真核生物基因组织结构

1.1.2 真核生物基因转录激活

1.2 染色质的表观调控

1.2.1 真核生物染色质的结构

1.2.2 核酸水平的化学修饰

1.2.3 组蛋白水平的修饰

1.2.4 染色质重塑

1.2.5 特定染色质分离纯化和结合蛋白的鉴定

1.3 神经元活性对基因表达调节

1.3.1 神经元活性诱发Ca2+内流

1.3.2 胞内Ca2+介导细胞核基因表达调节的信号通路

1.3.3 神经元活性对基因表达调节

1.3.4 神经元活性对基因表达的时程调节

1.4 表观遗传学在神经元活性对基因表达调节中的作用

1.4.1 表观修饰因子在神经元活性依赖的基因表达的作用

1.4.2 Ash1L参与的组蛋白修饰及基因表达的调节

1.5 Neurexins的生物学功能

1.5.1 Neurexins蛋白家族的结构

1.5.2 Neurexins在突触发生和突触传递中的作用

1.5.3 Neurexins在学习记忆中的作用

1.6 本文的研究目的和主要研究内容

第2章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株，细胞株和动物材料

2.1.2 质粒载体与病毒

2.1.3 药品和试剂

2.1.4 培养基与溶液配方

2.1.5 引物序列

2.2 实验方法

2.2.1 载体构建

2.2.2 感受态细胞热激转化，重组子筛选和质粒提取

2.2.3 GST融合蛋白的原核表达与纯化

2.2.4 Bradford法测定蛋白质浓度

2.2.5 利用锌指蛋白分离纯化Nrxn1α 启动子

2.2.6 串联质谱鉴定Nrxn1α 启动子结合蛋白

2.2.7 小鼠基因组DNA提取与基因鉴定

2.2.8 NG细胞株的培养、转染、诱导分化及活性刺激

2.2.9 小鼠皮层原代培养物的制备、转染与感染及活性刺激

2.2.10 RNA提取和RT-PCR

2.2.11 EMSA实验分析

2.2.12 Ch IP实验分析

2.2.13 SDS-PAGE及银染

2.2.14 sg RNA的特外转录与纯化

2.2.15 原核注射

2.2.16 荧光素酶双报告系统分析

2.2.17 Western blot实验

2.2.18 免疫组织染色脑组织切片制备

2.2.19 免疫组织化学染色

2.2.20 环境丰富化训练

2.2.21 情景型条件性恐惧记忆测试

2.2.22 依赖情景型恐惧记忆的分辨能力测试

2.2.23 依赖线索型恐惧记忆的分辨能力测试

2.2.24 统计学分析

第3章 Ash1L介导神经元活性对Nrxn1α 基因表达抑制

3.1 引言

3.2 实验结果

3.2.1 短暂的神经元活性刺激引起Nrxn1α 表达长时程抑制

3.2.2 Nrxn1α 启动子的分离与结合蛋白的鉴定

3.2.3 Nrxn1α 启动子结合蛋白的验证

3.2.4 神经元活性促进Ash1L与Nrxn1α 启动子的结合

3.2.5 Ash1L介导神经元活性对Nrxn1α 长时程抑制作用

3.2.6 Ash1L+/-小鼠制备与鉴定

3.2.7 Ash1L+/-小鼠海马体中Nrnx1α 的表达上调

3.2.8 敲除Ash1L能够解除神经元活性对Nrnx1α 的抑制作用

3.2.9 Ash1L+/-小鼠显示正常学习能力与运动能力

3.2.10 Ash1L+/-小鼠对恐惧记忆分辨能力缺陷

3.2.11 Carm1对Nrxn1α 的转录调节

3.3 结论

第4章讨论和展望

4.1 讨论

4.2 工作展望

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

个人简历

发表的学术论文

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