3多不饱和脂肪酸通过AMP/LKB1/AMPK信号通路调节肝再生的分子机制

  本文关键词：AMPK调控组蛋白糖基化修饰的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《南京大学》 2016年

ω-3多不饱和脂肪酸通过AMP/LKB1/AMPK信号通路调节肝再生的分子机制

伏晓  

【摘要】：背景：肝切除技术是治疗巨大肝脏肿瘤的有效方法,术后保护残肝功能,促进肝再生至关重要。临床实践表明,采用精准肝切除技术有望提高肝脏巨大肿瘤和位于复杂区域,如：肝门区域肿瘤的切除率。但是病灶切除后,残余肝脏能否再生发挥功能将直接影响患者的恢复和生存。因此,深入探讨肝切除术后肝再生的分子机制,寻找更具针对性的治疗靶点,对临床上安全、有效地开展复杂高难度肝脏外科手术具有重要意义。已有临床实验发现,在围手术期采用特殊性的营养支持治疗可以使患者肝脏损伤明显减轻,并发症显著降低。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)是临床营养支持中的脂肪乳剂,主要包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。大量研究证实ω-3PUFA可以通过多种信号传导通路抑制炎症反应,降低血清中TNF-α、IL-1、IL-6、NO等炎症因子水平,防止全身炎症反应综合征的发生,保护重要器官的功能。近期的研究发现：ω-3PUFA能够显著提高细胞内AMP的水平,有效防止p-AMPK(AMP-Activated Protein Kinase)的去磷酸化,对肝再生后肝功能的维护具有一定的价值。目的：建立小鼠原代肝细胞三维立体培养模型,在小鼠原代肝细胞三维立体培养模型的基础上,观察ω-3PUFA对肝细胞胆小管形成的影响,并探讨AMP/LKB1/AMPK信号通路在其中的作用机制。方法：二步灌注法提取25～30gICR小鼠原代肝细胞,并利用Ⅰ型胶原和基底膜基质胶进行三维立体培养,观察6小时、过夜培养和72小时肝细胞的生长状态。用200 mM ω-3PUFA DHA作用于原代肝细胞,观察24小时后肝细胞之间胆小管的形成速度；用高效液相色谱法检测ω-3PUFA DHA作用于肝细胞0、0.5、1、6、12、24小时后细胞内AMP、ATP的水平,并计算AMP/ATP的比率；western blot方法检测ω-3PUFA DHA作用于小鼠原代肝细胞0、0.5、1、6、12、24小时后细胞内LKB1 (liver kinase B1)、p-LKB1、AMPK、p-AMPK的蛋白水平。此外,利用有效结构域突变的LKB1和AMPK过表达腺病毒感染原代肝细胞,阻断LKB1/AMPK信号通路,再次加入ω-3PUFADHA24小时后,观察胆小管的形成速度,从而确定LKB1/AMPK信号通路在胆小管形成过程中的作用。结果：小鼠原代肝细胞在三维立体培养的条件下,可以发生极化并生成胆小管。小鼠原代肝细胞接种6小时后,已经基本贴壁,细胞形态呈圆形；小鼠原代肝细胞过夜培养后,已经铺展开,互相接触；小鼠原代肝细胞三维立体培养72小时后,胆小管大量形成并互相连接成网状。肝细胞用ω-3PUFA处理后,胆小管的形成速度明显加快。co-3PUFA处理小鼠原代肝细胞后,与对照组相比,在处理0.5小时后,肝细胞内AMP水平升高,ATP水平下降,AMP/ATP比率升高,结果有统计学差异(P0.05)；与对照组相比,在处理0.5小时后,LKBl和AMPK蛋白活化水平增高,结果有统计学差异(P0.05)；AMP/ATP比率升高的时相与LKB1/AMPK活化的时相相同。用有效结构域突变的过表达腺病毒分别抑制LKB1和AMPK以后,再次加入ω-3PUFA DHA,胆小管的形成明显受到明显抑制。结论：ω-3PUFA通过提高AMP/ATP的比率调控LKB1/AMPK通路,促进肝细胞极化。实验结果为ω-3PUFA在肝切除术围手术期的应用提供理论依据。

【关键词】：
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

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