锌离子转运蛋白SLC39A5在食管癌组织中的表达以及在食管癌细胞KYSE170中的作

发布时间：2016-11-29 09:52

  本文关键词：A549细胞对外源金属离子刺激响应信号转导过程的蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

《河北医科大学》 2015年

锌离子转运蛋白SLC39A5在食管癌组织中的表达以及在食管癌细胞KYSE170中的作用及机制研究

吴岩  

【摘要】：目的:食管癌是常见的恶性肿瘤,发病率为6.5/10万,居所有恶性肿瘤第八位;死亡率为5.7/10万,居所有肿瘤的第六位,严重威胁着人类健康。食管癌的发病与多种环境因素相关,包括遗传因素、食管局部损伤、嗜烟酒、亚硝胺类食物、霉菌及病毒感染、维生素及微量元素缺乏等,但其确切病因研究尚未取得突破性进展。伴随着分子生物学和高新生物技术的发展,对食管癌发生发展分子机制的研究及相关生物学标记物的探索已成为医学研究热点。ZIP5是锌离子转运蛋白SLC39A(ZIP)家族即溶质结合转运体蛋白家族的一员,与锌的跨细胞转运关系密切,食管癌组织的全基因表达谱芯片筛查发现包括ZIP5在内的19种基因异常表达,提示ZIP5在食管癌发生中可能具有重要作用,但具体作用机制尚未见报道。本实验通过比较ZIP5在食管癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达差异,以及与COX-2表达的相关性,探讨ZIP5与食管癌发展的作用和机制。在已建立的稳定沉默ZIP5基因食管癌细胞系KYSE170的基础上,在细胞水平观察沉默ZIP5基因对食管癌细胞增殖、侵袭的影响并对ZIP5作用于食管癌细胞的分子机制进行探讨,为食管癌的预防以及靶向性治疗提供实验基础和理论依据。方法:1收集手术切除食管癌患者的食管癌组织、癌旁组织、正常组织58例。利用免疫组化方法比较ZIP5和COX-2蛋白在食管癌组织、癌旁组织与正常组织中的表达差异,统计分析其与临床病理特征的关系以及二者的相关性。2培养稳定沉默ZIP5基因食管癌细胞系KYSE170K及转染空载体细胞系KYSE170S,用MTT和CCK-8法绘制两组细胞系的生长曲线,并检测细胞活力及细胞增殖情况;Transwell法检测细胞迁移和侵袭情况;用PCR和Western Blot法验证ZIP5的沉默效果,并检测与肿瘤相关基因COX-2、Cyclin D1及E-cadherin等在两组细胞中的m RNA及蛋白水平的表达差异,探讨ZIP5作用于食管癌细胞的分子机制。结果:1免疫组化结果显示:在58例食管癌患者的癌组织、癌旁组织和正常组织中,ZIP5基因阳性表达例数分别为53例,30例和6例,ZIP5在癌组织、癌旁组织和正常组织的表达量分别为:4.64±3.67,1.14±1.29和0.19±0.66;在58例食管癌患者的癌组织、癌旁组织和正常组织中,COX-2基因阳性表达例数分别为36例,28例和1例,COX-2在癌组织、癌旁组织和正常组织的表达量分别为:2.09±2.23,1.14±1.57和0.02±0.13。ZIP5和COX-2在癌组织中的表达明显高于癌旁和正常组织,并且与淋巴结转移,浸润深度和分化程度相关,ZIP5和COX-2在食管癌组织中的表达呈正相关。2 MTT结果显示:细胞生长12h、24h、48h和72h后,空载体组KYSE170S的OD值分别为0.206±0.034,0.417±0.076,0.64±0.045和1.130±0.053;稳定沉默ZIP5组KYSE170K的OD值分别为0.120±0.052,0.185±0.048,0.291±0.060和0.512±0.071,沉默ZIP5组较空载体组细胞生长明显减慢(P0.05)。3 CCK-8结果显示:细胞生长12h、24h、48h和72h后,空载体组KYSE170S的OD值分别为0.477±0.085,1.043±0.092,1.143±0.115和1.343±0.087;稳定沉默ZIP5组KYSE170K的OD值分别为0.239±0.051,0.492±0.083,0.581±0.054和0.777±0.059,沉默ZIP5组较空载体组细胞生长明显减慢(P0.05)。4 Transwell结果显示:细胞生长24h后,未加入基质胶的小室,空载体组穿过细胞数量约为3500±206.23,沉默ZIP5组穿过细胞数约为1500±127.68,加入基质胶的小室,空载体组穿过细胞数量约为1200±106.49,沉默ZIP5组穿过细胞数约为500±78.74,沉默ZIP5明显降低细胞的迁移和侵袭能力57.2%和58.4%。5 Real-time PCR结果显示:COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在空载体组KYSE170S的m RNA表达量分别为0.892±0.075,0.703±0.034和0.365±0.036;COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在沉默ZIP5组KYSE170K的m RNA表达量分别为0.314±0.044,0.229±0.042和0.732±0.051,COX-2和Cyclin D1在m RNA水平表达分别下降了64.8%和67.4%,E-cadherin则上升了50.2%,差异有统计学意义(P0.05)。6 Western Blot结果显示:COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在空载体组KYSE170S的蛋白表达量分别为0.654±0.036,0.873±0.075和0.256±0.064;COX-2、Cyclin D1和E-cadherin在沉默ZIP5组KYSE170K的蛋白表达量分别为0.284±0.051,0.318±0.044和0.437±0.082,在沉默ZIP5后,COX-2和Cyclin D1在蛋白水平表达分别下降了56%和63%,E-cadherin则上升了41.5%,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1 ZIP5在食管癌组织中高表达,在癌旁组织中等表达,在正常组织低表达。ZIP5表达与食管癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移相关。2 ZIP5和COX-2在食管癌中的表达具有相关性。3稳定沉默ZIP5后,食管癌细胞KYSE170的增殖和侵袭能力受到明显抑制。4稳定沉默ZIP5后,食管癌细胞KYSE170的COX-2和Cyclin D1在m RNA和蛋白水平表达降低,E-cadherin在m RNA和蛋白水平表达上升。

【关键词】：
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

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